Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

ые цепи в биологически активный инсулин, хотя и с низким выходом *(2 — 5%), так что синтез гормона уже

представлился реальной задачей В начале 60 х годов одновременно в двух лабораториях — П. Катсоянниса (США) и X. Цана (ФРГ) начались работы по синтезу цепей инсулина. Группа X. Цана синтезировала фрагменты 1 — 9, 10 — 21 цепи А и фрагменты 1 — 8,

9 — 14, 15 — 20 и 21 — 30 цепи В, а П. Катсояннис получил такие же фрагменты цепи А и несколько другие для цепи В: 1 — 9,

10 — 13, 14 — 20, 21 — 30. Фрагменты были соединены в цепи А и В, освобождены от защитных групп и переведены в S-сульфонаты. Окисление смесей S-сульфонатов цепей привело к продуктам, обладающим активностью инсулина. Кристаллический образец чистого синтетического инсулина быка впервые получен китайскими химиками в 1965 г. в результате синтеза, проведенного по сходной схеме (Я. Кунг) (см. с. 157).

Синтезы инсулина, осуществленные тремя группами — П. Катсоянниса в США, Я. Кунгав КНР и X. Цана в ФРГ в 1963 — 1965 гг., сыграли значительную роль в совершенствовании методологии синтетической пептидной химии.

Следующей вехой в развитии синтетических исследований был синтез S-белка рибонуклеазы А, предпринятый в США под руководством Р. Хиршмана (1963 — 1969). Стратегия синтеза (рис. 82) отличалась от применявшихся ранее подходов тем, что авторы стремились использовать минимальное число защитных группировок и упростить стадии конечного деблокирования. В ходе синтеза был предложен способ удлинения пептидной цепи N-карбоксиан-гидридами аминокислот (см. с. 143) и введена в практику ацетами-дометильная группа для SH-функции. В итоге шестилетнего труда Р. Хиршман и сотр. получили продукт, обладающий в присутствии S-пептида 30% активности рибонуклеазы А и рядом ее физико-химических показателей.

Среди классических синтезов простейших белков необходимо отметить синтез рибонуклеазы А, состоящей из 124 аминокислотных остатков (X. Яджима, 1980), и синтез нейротоксина 11 (61 остаток) из яда среднеазиатской кобры Naja naja oxiana (В. Т. Иванов и сотр., 1982).

Синтез рибонуклеазы А (Б Гутте Р Меррифилд, 1969 — 1971) и р-липотропина, содержащего 91 аминокислотный остаток (Ч. Ли, Д. Ямаширо, 1978), был осуществлен твердофазным методом.

159

Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

Квтсояннис IKatsoyennls) Панайотнс

(р. 1924), американский биохимии. Образование получил в Афинском университете, с 1952 г. работал в Корнелл-ском университете, затем в Брукхевен-ском центре медицинских исследований и Нью-Йоркском университете. Известный специалист в области синтеза пептидов. Осуществил (1964) один из первых полных синтезов инсулина.

Химическая модификация белков и пептидов

Задачи химической модификации белково-пептидных веществ, как правило, связаны с выяснением связи между их структурой и биологической функцией. Естественно, при этом могут преследоваться и другие цели, например создание практически важных препаратов с заданными свойствами.

В зависимости от решаемых задач и применяемых методов принято различать следующие типы химической модификации белков и ептидов

Замена одного или нескольких аминокислотных остатков на другие и получение на этой основе разнообразных аналогов природных соединений. Такая модификация пептидов достигается

160

Белки и пептиды

Цан (Zar.nl Хельмут (р. 1916), немецкий химик-органик, иностранный член АН СССР (I9B2) Окончил Высшую техническую школу в Карлсруэ (1940), работает в Институте исследования шерсти при Текнич ском университете в А к н (ФРГ). Известен работами в области химии натуральных и синтетических волокон, один из ведущих специалистов по химии пептидов. Впервые синтезировал инсулин (1963).

методами пептидного синтеза (см. с. 151), а белков — посредством так называемого «направленного мутагенеза» (см. с. 379).

Модификация отдельных аминокислотных остатков с помощью селективных химических реагентов. Специфичность реакции определяется природой боковой цепи аминокислотного остатка, пространственным строением модифицируемого соединения и условиями реакции.

Модификация с помощью бифункциональных реагентов, взаимодействующих одновременно с двумя или более функциональными группами белков.

Направленная биоспецифическая модификация по «точному адресу», так называемое «аффинное мечение». Широко известно, например, применение субстратоподобных агентов для химического исследования природы и локализации активного центра ферментов или иных систем. Как биоспецифическую модификацию можно рассматривать и некоторые процессы модификации белков, такие, как фосфорилирование, ацилирование, гликозилирование метилирование, протекающие в клетке с участием соответствующих ферментов.

Введение различных химических меток, репортерных групп, расширяющих возможности физико-химических методов (ЯМР и ЭПР-спектроскопия, масс-спектрометрия, рентгеноструктурный анализ и др.) при исследовании структуры и функции белков (см. с. 111).

Ковалентное присоединение белка или пептида к полимеру с целью получения так называемых «иммобилизованных» препаратов (например, иммобилизованных ферментов) или создания высокоселективных носителей для биоспецифической (аффинной) хроматографии.

Топохимическая модификация (трансформация) пептидных систем, используемая при конструировании биологически активных аналогов природных соединений.

Ниже более подробно рассматриваются некоторые из перечисленных типов химической модификации.

Селективная модификация аминокислотных остатков

Белок является полифункциональным соединением, в котором каждый аминокислотный остаток выполняет определенную роль в поддержании нативиой конформацни или проявлении биологической функции. Если используются модифицирующие агенты достаточно широкой специфичности, конечный результат зависит от доступности тех или иных функциональных групп белка в данных условиях. В частности, ацилирование с помощью радиоактивно меченного уксусного ангидрида было предложено в качестве метода локализации остатков лизина, расположенных на поверхности белковой глобулы (Б. Хартли). Этот прием широко применяется и для исследования топографии мембранных белков, когда доступными действию так называемых непроникающих реагентов оказываются лишь группировки, расположенные вне мембраны.

В настоящее время известно значительное число специфических реагентов, селективно модифицирующих боковые цепи аминокислот. Большинство из приведенных ниже реакций применяется для выявления функционально важных аминокислотных остатков. Многие

из них используются также при исследовании структуры белков и пептидов.

Лизин. е-Аминогруппы остатков лизина являются весьма удобными мишенями для модификации. Наибольшее распространение при этом получили следующие методы: а) ацилирование с помощью уксусного, трифторуксусного или янтарного ангидридов, S-этил-трифторацетата; иногда применяется обратимое ацилирование мвлеиновым или цитраконовым ангидридами (см. с. 43); б) а рил и рование; в) реакция с нмидоэфирами; г) образование шиффо-

161

Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

nh—со—cf I

(сн,),

hn—сн-

С2НБ_ S—СО —CF

рН 10,0;0°с

N02

nh—// V-МСЬ --hn—сн—со

^NH

nh—с

^сн3 _NH (сн ), СНэ-О-С

I (¦)

hn—сн—со —«--

рН 7.0-10.5

СН

NH

nh—с | ^ nh2

(сн,). н,с—О—с*

hn—сн—со ~«_

рН 11,0

.hn—сн—со

nh—сн.—r

(сн.). I

NH—СН—СО

вых оснований с последующим восстановлением боргидридом натрия; д) гуанидирование (до производных гомоаргинина); е) карбамоилирование, а также дансилирование. Последняя реакция широко используется при анализе первичной структуры белков и пептидов (см. с. 37), а также для введения флуоресцентной метки в белки. Все перечисленные реакции могут применяться и для модификации N-концевой аминогруппы белков и пептидов.

Аргинин. Для модификации гуанидиногруппы остатков аргинина используются гидразинолиз до производных орнитина (см. с- 65) и конденсация с 1,2-дикетонами (например. 1,2-циклогександио-

ном), позволяющая обратимо модифицировать остатки аргинина (см. с. 44), а также указанные на схеме реакция с 1,3-дикарбониль-ными соединениями и их производными (нитромалоновый альдегид, тетраэтоксипропан) (а) и реакция с фенилглиоксалем (б).

Н

Н-сАс-Н

I II

N N

I

NH

I

(СН) I

- HN—СН—со

сн2 /\

(HjCjOjjHC СН(ОС2НБ)

. N02

Сн

/\ онс сно

(a) (а)„

NO

чсЛс^н

I II

N N

I

тн

(СН,), HN—СН—СО

HN^ NH

I

NH

(СН-), HN—СН—СО

HN—CH—СО

Феиилглионсаль

НО он

HN NH

\ / С

Бора

N

(СН,) HN—СН—(

Фенил |иоксаль

¦Л

/ \

о о

он-

HN NH

V

N I

(СН..),

I

HN—сн—со

Цистенн. Сульфгидрильная группа остатка цистеина является 163

одной иа наиболее реакционноспособных в белках, и она особенно -

часто подвергается химической модификации. Для этой цели при- Синтез меняются: а) алкилирование иодуксусной кислотой или иодацета- м химическая модификация

белков и пептидов

мидом (используется для защиты сульфгидрильных групп от окисления в ходе структурного изучения белков и пептидов); б) амн-ноэтилирование с помощью этиленимина (азиридина) (см. с. 44): в] реакция с п-хлормеркурнобензойной кислотой (П. Д. Боиер 1954) (часто применяется для количественного определения SH-групп в белках и пептидах); г) окисление с помощью О Н;0^ или надмуравьиной кислоты до производных цистеиновой кислоты (В.Хирш, 1956), одновременно могут подвергаться окислению остатки Тгр (в формилкннуренин) и Met (в сульфоксид и суль-фон); д) окисление в мягких условиях с образованием меж- или внутримолекулярных дисульфидных связей под действием нода, феррицианида I Fe (CN) Cj | '* , о-иодозобензойной кислоты, Н202; е) реагенты, приводящие к получению несимметричных дисульфидов, в частности реагент Эллмана, применяемый для количествен иого определения сульфгидрильных групп в белках (см. с. 75), н азобензол-2-сульфенилбромид (А. Фонтана, 1968); ж) конденсация с N эти ма еимидом модификации могут подвергаться также остатки His и Lys, но при рН 7,0 скорость реакции с SH-группой в 10 раз выше.

164 Цистин. Для модификации дисульфидных групп остатков

~ ~" цистина в основном применяются: а) восстановление тиолами.

Белки и пептиды наиболее широко используется дитиотреитол (ДТТ — реактив Кле-

ланда, 1964); образование циклического дисульфида при реакции с ДТТ термодинамически выгодно, скорость аналогичной реакции с р-меркаптоэтанолом в И)4 раз ниже; б) окислительный сульфито-лиз, реакция протекает в присутствии окисляющих агентов (02, иодозобензойная кислота и т. п.) н катализируется цистеином или Р-меркаптозтиламином; в) расщепление цианидами (Р. Вуд, 1963), реакция обычно сопровождается циклизацией тиоцианопроизвод ных в ацилиминотазолидины (см. с. 52); г) окисление надмуравьиной кислотой (С. Энгер, 1949).

X?

+21-

СН I

---HN—СН-

SH I

СН

СН—со----

S—SOi"

I

сн

I

----HN—сн—со-----1-----HN—сн—со----

рН 7/0-8.5

---HN—СН НС—NH

I I

—ос со—

I—со-----h ¦

SOaH CH

+ 2[----HN—CH—CO----]

Метионин. Для модификации остатков метионина применяются: а)окисление H,Oj, надмуравьиной кислотой нли фотоокисление (в присутствии метиленового синего) до сульфона; б) алкилирование иодуксусной кислотой, иодацетамидом или R-пропиолактоном с образованием сульфониевых солей.

Деградация сульфониевых солей метионина в пептидах при кипячении в воде сопровождается расщеплением связи, образован-

СНз СН, СНЭ

I I I

+s—снгсоо- s s . о

I I I

(CH,), (СН ) (CH )

ICHjCOO- I 1о' I

HN—СН—СО-----«-----HN—СН—СО----- -»¦----HN—CH—СО -

рН 1.7

,6| Ю1

ной карбоксильной группой метионина (аналогично тому, как это происходит при действии бром циана см. с. 48). Наилучший выход (50%) достигается при а ки ировании иодацетамидом.

При действии на сульфониевые производные р-меркаптоэта-нола происходит количественная регенерация метионина.

Аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Карбоксильные группы остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот обычно модифицируют путем превращения их в сложные эфиры (реакция этерифика-ции) или продукты взаимодействия с водорастворимыми карбо-диимидами (см. с. 131). Для этерификации используются: раствор хлористого водорода в метаноле, диаэометан, диазоацетамид или борфторид триэтилоксония.

165

Синтез

химическая модификация белков и пептидов

HCI сн„он .

(СНг)„

I

. HN—СН—СО -

П=«1 или 2

N,CHCONH3

Cu2*;pH 5,0; 15'С

(C2H5)30*BF."

с.

Iхосн,

|СН2)„ -СН—со -

I \о—CHi—СО—NH, [СН,)„

-сн—со

<

I nO—CjHs (CH2)n

1

HN—СН—СО

рН 4.5; 25" С

Гйстидин. Имидазольное кольцо гистидина реагирует с 1-фтор-2,4-диннтробензолом и а-галогенкислотами. но эти реакции малоселективны. Лучшие результаты дает диаэотирование с помощью диазотетразола.

N_N

N NH

рН 8,0

166 Для модификации остатков гистидина в белках, особенно в актив-

- ных центрах ферментов, ранее широко применялось енсибилизиро

Белки и пептиды ванное красителями фотоокисление (В. Рей, 1967). В последнее же

время предпочитают ис пользовать диэтилпирокарбонат, который при рН 5,5 — 7,5 достаточно специфично реагирует с остатками гистидина.

(С2н5ОСО)аО

Тирозин. Остатки тирозина модифицируются достаточно легко и селективно. Для этого широко используются: а) иодирование, особенно с помощью радиоактивных изотопов ' "*1 и IJ,1, в частности иодирование применяется для введения тяжелого атома при рентге-

он он

NH;OH

неструктурных исследованиях; для электрофильного замещения \(j

протона ароматического кольца тирозина нужен катион 1+, по- - -

лучаемый в реакционной смеси из иоднд-аниона под действием Синтез

химического окислителя — N-хлортолуолсульфамида натрия (хло- и химическая модификация

рамин Т) или ферментной окислительной системы (лактоперокси- белков и пептидов

даза, Н202) (М. Моррисон, 1968); б) окислительное бромирование

с помощью N-бромсукциннмида; вначале образуется дибромпро-

изводное, а дальнейшее окисление приводит к разрыву пептидной

связи и образованию диб ром дне нон спиролактона в) реакция с

цианурфторидом, позволяющая спектрофотометр и чески определять

количество доступных остатков тирозина; г) ацетнлирование

N-ацетилимидазолом; д) нитрование с помощью тетранитрометана.

Побочной реакцией в последнем случае может быть внутри- и

межмолекулярная «сшивка».

Триптофан, а) Для модификации остатков триптофана используется реакция с N-бромсукцинимидом (Б. Виткоп, 1970); реакция может останавливаться на стадии бромпроизводно о или приводить далее к расщеплению пептидной связи, образуемой карбоксильной группой остатка триптофана. В последнее время для этих целей более эффективно используется BNPS-скатол (см. с. 50). Среди других методов модификации остатка триптофана следует отметить: б) алкилирование 2-гидрокси-5-нитробензнлбромидом (Д. Кош-ланд, 1964); в) реакция с 2-нитрофенилсульфенил хлоридом

168

Белки и пептиды

С—СНг—СНг—СНг—С

Глут яроаын альдегид

1ч,М-(1,2-Фенилен)-

(Э. Скоффоне, 1°72); г) фор мили рование безводной муравьиной кислотой, насыщенной газообразным НО, д) фотоокисле

страница 22
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.10.2017)