Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

проведены пераые исследования по ферментативному синтезу пептидов.

150 Установлено, что протеолитические ферменты — химотрипсин,

- папайи, термолизин и др. в специфических буферных растворах.

Белки и пептиды чаще всего в водно-органических смесях, в принципе способны ката-

лизировать образование пептидных связей между аминокислотами и пептидами. Схематически катализируемую ферментами реакцию гидролиза-аминолиза можно представить следующим образом:

R1 R RJ

I I I

----СО—NH—СН—СО—NH—СН—СООН + H2N—СН—СО----

R' R3 Аминолиз _ III

----СО—NH—СН—СО—NH—СН—СО—NH—СН—СО— ¦

Гидролиз

В водной среде равновесие такой реакции обычно сдвинуто в сторону гидролиза, однако направленное изменение условий реакции (ее термодинамических и кинетических параметров) позволяет сместить равновесие в сторону синтеза. В частности, необходимо обеспечить низкую растворимость синтезируемого пептида и/или высокую концентрацию исходных компонентов. Для этого используют соответствующие комбинации зашитных групп, смешивающиеся или несмегпивающиеся водно органические смеси (такие, как ДМФА — вода, диоксан — вода, хлороформ — вода, этилацетат — вода), рН контроль иммобилизованные ферменты.

В качестве примера рассмотрим синтез дипептида Ас—Phe— Ala—NHj под действием химотрипсина. Известно, что химотрипсин расщепляет амидные и сложноэфирные связи, образованные карбоксильными группами ароматических аминокислот Phe, Туг, Тгр. Реакция протекает через промежуточную стадию образования ацилфермеита, который далее деацилируется с участием воды как нуклеофила. В присутствии других нуклеофилов — аминокислот, их амидов и пептидов можно получить продукты как гидролиза, так и аминолиза.

Ae-Phe—OEt + Химотрипсин k.,|Jk,

(Ac—Phe—OEl) - Химотрипсин (комплекс)

k_JJk2

Ac—Phe — Химотрипсин (ацилфермент)

но Ale"NHa

Ac—Phe + Химотрипсин Ac—Phe—Ale—NHj + Химотрипсин

Соотношение констант скоростей гидролиза (к.,) и аминолиза (к^) определяет направление реакции и зависит от концентрации нуклеофилов. Найдено, что при рН 10,0 и 1 М концентрации RNH2(Ala—NHj) выход пептида Ас—Phe—Ala—NH^ составляет 95%.

С помощью такого подхода в настоящее время можно синтезировать небольшие пептиды. Например, при использовании в качестве катализаторов химотрипсина, термолизина и папаина был получен гексапептид последовательности 6 — 11 эледоизина: Вое—Ala— Phe—Не—Gly—Leu—Met—NH? (X. Я кубке) Преимуществами синтеза с участием ферментов являются отсутствие рацемизации, возможность работы с минимальным числом защитных группировок, высокая скорость протекания реакций. Однако не исключены побочные реакции тра не пептида ци и, гидролиза, приводящие к образованию сложных реакционных смесей. *

Полусинтез пептидов и белков

Полусинтез (семисинтез, частичный синтез) — способ получения соединений, заключающийся в комбинировании природных пептидов и белков или их фрагментов с пептидами, полученными полным синтезом или модификацией природных объектов. Полусинтез можно рассматривать как методический прием, основанный на модификации природных соединений.

Известные в структурной химии белка способы ферментативного и химического расщепления пептидной цепи и разделение образующихся в результате фрагментов с помощью хроматографической техники позволяют получать гомогенные пептидные блоки. С помощью различных методов можно осуществить целенаправленное изменение нужного фрагмента (укорочение, удлинение, введение новых остатков и т. п.) и затем собрать из блоков новые, видоизмененные последовательности. Защитные группы при полусинтезе выбираются таким образом, чтобы их введение сохраняло способность производных растворяться в водных и водно-органических растворах. При сборке нужной последовательности из подготовленных пептидных блоков чаще всего используются такие методы, как DCC/HOBt, DCC/HOSu, а также азидный метод и метод активированных эфиров. Особое внимание уделяется при этом проблеме рацемизации.

Полусинтез как способ получения соединений пептидно-белковой природы можно проиллюстрировать на примере инсулина. В 1972 г. впервые было осуществлено превращение инсулина свиньи в инсулин человека (М. Руттенберг). Молекулы этих гормонов отличаются лишь одним аминокислотным остатком: в положении В 30 в инсулине свиньи находится Ala, а в инсулине человека—Thr Предложенная схема (рис. 80) включала синтез гексаметилового эфира инсулина свиньи (обработкой диазометаном), расщепление В-цепи трипсином по остатку Arg-22, блокирование Вос-группой N-концевых остатков А- и В-цепей полученного «укороченного» инсулина, затем конденсацию продукта с синтетическим фрагментом В 23 — 30 инсулина человека (DCC/HOSu методом) и, наконец, удаление всех защитных групп. После интенсивной очистки удалось выделить инсулин человека с выходом около 10%.

Позднее (1980— 1983) были предложены еще два способа ферментативного превращения инсулина свиньи в инсулин человека

151 Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

Фрутон IFruton) Джозеф С. (р (912) американский биохимик. Окончил Колумбийский университет (1934), с 1957 г.— профессор биохимии Польского университета. Основные работы посвящены химии белков, пептидов и аминокислот, изучению специфичности и механизма действия про ео литических ферментов, истории биохимии.

152 (К. Морихара, Дж. Маркуссен). В 1983 г. разработан способ про-

мышленного производства инсулина человека из инсулина свиньи,

Бепки и пептиды основанный на применении иммобилизованной протеиназы 1 из

Achromobacter lyticus на стадиях гидролиза инсулина в дез-Ala В—30 инсулин и конденсации последнего с Thr—OBu1 (Т. Ока).

1

H-Gly-Glu-

H-Gly-Gl I

CH.N2 -Glu-

21 -OH

-Glu-Arg-Gly Lys •22 23 29

Инсулин свиньи

-Glu-Arg-Gly-Lys-Ala-OMe

I

OMe

О Me J_

OMe

-OMe

-|-Arg-OH

OMe

BocN3

—Г

OMe _I_

-1-Arg-OH

OMe

H-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OMe

__ Boc

--OMe

OMe _I_

OMe

1~

OM<

Деблокиров.ни

Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-s -Thr-Pro-Lyi-Thr-OMe

I

Boc

--Thr- jH

Инсулин человена

Рис. 80. Полусннтеэ инсулина чеювека из инсулина свиньи.

Синтез циклопептидов

153

Синтез

Для получения циклических пептидов используются обычные и химическая модификация

для пептидного синтеза методы создания амиднои связи Чаще бепков и пептидов

всего первоначально создается линейный предшественник в виде защищенного пептида, активируется С концевая карбоксильная группа, освобождается N-концевая аминогруппа и проводится реакция аминолиза собственной аминогруппой пептида. Для уменьшения межмолекулярных реакций аминолиза, приводящих к полимеризации и вследствие этого циклоолигомеризации, реакции циклизации проводят в условиях высокого разбавления в инертных растворителях. Однако, как правило, побочные реакции полимеризации всегда имеют место и уменьшают выход циклического продукта. Лучшие результаты дает метод получения циклопептидов на поли мерном носителе (см. с. 148).

R R1 R R1

II - I I .

H2N—СН—СО - СН—СО—Y-»~г[— NH—СН - • • CH—СО—J п

= 1, 2. 3,

Выход циклических продуктов сильно зависит от стерических факторов: напряженности образующегося цикла, разветвленности боковых радикалов, термодинамических и конформационных параметров.

Синтез гетеродетных пептидов

Среди соединений пептидно-белковой природы нередко встречаются такие соединения, которые наряду с обычными амидными связями содержат и связи другого типа. Такие пептиды называются гетеродетными (гомодетные пептиды построены только из аминокислот соединенных с помощью амидных связей) В группу гетеро детных пептидов входят: депсипептиды, в составе которых есть гидроксикислоты или гидроксиаминокислоты; S-пептиды, содержащие тиоэфирную связь между остатками: (S—S)-пептиды, содержащие дисульфидную связь: пликопептиды, содержащие N- или О-гликозидные связи, и т. д. (см. с. 472 и 474).

(S—5)-Пептиды. Остатки цистеина в пептидах и белках образуют дисульфидные связи, соединяющие участки одной цепи или отдельные пептидные цепи. (S — S) -Содержащие пептиды могут быть линейными и циклическими.

Создание дисульфидных связей обычно проводится на одном из последних этапов синтеза обработкой соответствующего тиоль-ного предшественника с помощью подходящих окислителей: кислорода воздуха, иода, феррицианида калия KjFe(CN)h. Если в цепи имеется лишь два остатка цистеина, то при окислении SH-rpynn

кроме циклического дисульфида получаются циклические и линейные полимергомологи, степень образования которых можно уменьшить проведением процесса в условиях высокого разбавления.

Значительно более сложная ситуация возникает при синтезе соединений с несколькими дисульфидными связями. Например, если в пептиде содержится 6 остатков цистеина (3 дисульфидных связи, как в рибонуклеазе А), то формально возможно образование 105 структурных изомеров с разными дисульфидными связями. В этом случае направление и полнота реакции обычно определяются специфической укладкой пептидной цепи, что позволяет проводить самопроизвольное окислительное замыкание нужных дисульфидных связей. Естественно, здесь требуется тщательный подбор условий: окислитель, концентрация, рН среды, температура, причем даже в оптимальных условиях выход целевого продукта невысок и не исключается образование побочных соединений.

S Пептиды. Продукты ацилирования меркаптогруппы Cys-содер-жащих пептидов производными аминокислот называют S пептидами (или тиодепсипептидами). Их получают, используя различные активированные производные аминокислот (хлорангидриды, активированные эфиры и др), например

Z-Phe

Form-Cys-OH-Z-Ph.-CI ^ Form-Cys-OH

К S-пептидам относятся и пептиды, содержащие остатки лантио-нина или fi-метиллантионина (антибиотики низин, субтилин, дура-мицин, циннамицин). В. Дю Виньо и Г. Браун (1941) получили лантионин обработкой цистеина метиловым эфиром 2 амино 3-хлорпропионовой кислоты в щелочной среде:

H2N— СН—СООН I

СНЭ I

SH S

I I

СН2 СНа

1 ОН" 1

Н2|М—СН—СООН 1- H2N—СН—СООСНз - H2N—СН—СООН

I

СНз—CI

Депсипептнды. Депсипептиды составляют большую группу природных соединений, содержащих остатки гидроксикислот (в том числе и гидроксиаминокислот), связанных с другими остатками в цепи не только амидными. но и сложноэфирными связями. Особенность синтеза депсипептидов состоит в создании сложноэфирной связи. Для ацилирования малореакционнеспособных вторичных

гидроксигрупп пригодны лишь методы с сильной активацией карбоксильного производного — хлорангидридный, дициклогексилкарбо-диимидный, смешанных ангидридов, имидазолидный.

155

Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

XNH—CHR1—COCI + НО—CHR2—COY -XNH—CHR1—СОО—CHRa—COY

В синтезах природных депсипептидов для создания сложно-эфирной связи широко использовались смешанные ангидриды производных аминокислот, полученные при действии бензолсульфо-хлорида в пиридине (Дж. Плесе, 1961):

XNH—CHR'—СООН i НО—CHR"'—COY-- ' *—s— XNH—CHR - COO — CHR'—COOY

Стратегия синтеза депсипептидов предусматривает, как правило, сначала создание сложноэфирных связей, а затем соединение полученных блоков путем образования амидных связей. Такой подход более рационален, особенно при получении регулярных депсипептидов, так как для создания амидных связей можно использовать практически любой из обычных методов пептидного синтеза. Часто для этих целей применяется высокоэффективный хлорангидридный метод, причем при соблюдении соответствующих условий удается избежать рацемизации. С помощью указанных методов синтезированы депсипептидные антибиотики — валиномицин, энниатины и множество их аналогов (М. М. Шемякин, Ю. А. Овчинников с сотр., 1962 — 1977).

ОН

I

^ОН ОС^ -С^ —со^

V*4*" СО— N ^CO — ^СО—NH^

(а) (С) (в)

Принципиально другой метод синтеза депсипептидов основан на реакции гидроксиацильного включения (а—>в) в амиды, аудированные остатками гидроксикислот (а), которая протекает через промежуточные циклолы (б) (М. М. Шемякин. В. К. Антонов с сотр., 1963).

156 С помощью этой реакции были синтезированы в три стадии анти-

- биотик серратамолид и ряд его аналогов с модифицированными

Белки и пептиды боковыми цепями. О О Диацетилированныи 2,5-дикетопипе-

разин серина был N-ацилирован хлорангидридом О-бензил-З-гид-роксидекановой кислоты, подвергнут гидрированию и далее продукт перегруппировки кислотным гидролизом превращен в серратамолид.

Bxl CH.GAC

Jo Ах ^

О Bzl

j J CH3(CHa),CHCH,COC|^ Jb • i

o^nh^ch,oac 4:o''NvY'CO

AcOCH, Bll CH.Oac CH2OH

4o'nvco^c'h'5 4o'nvco^^cih,s

CH,OAc CHjOH

С eppti твмО fi И Д

H2/Pd

OHi6

По энергетическим причинам реакция гидроксиацильного включения легко проходит лишь в случае, если образующийся цикл содержит 10 или более атомов в кольце

Примеры синтеза пептидов и белков

Классическим и твердофазным методами синтезировано большое число пептидов, в том числе природных.

Первым синтезом пептидного гормона был синтез окситоцина, осуществленный В. Дю Виньоссотр. в 1953 г. Синтез проведен блочной конденсацией по схеме 2+7(3 + 4). С-Коицевой трипептид (7—9) Z—Pro—Leu—Gly—OEi (рис. 81) получался методом смешанных ангидридов и после удаления Z-группы гидрированием конденсировался с дихлорангидридом дикарбобензоксици-стина. Образовавшийся симметричный бис-тетрапептид (6—9) после омыления эфира и обработки Na/NH < для удаления Z-группы S-бензилировался и переводился в соответствующий бензиловый эфир. Последний подвергался аммонолизу, в результате чего получался исходный С-конце вой блок Н—Cys(Bzl) — Pro—Leu— Gly—NH.. Для синтеза следующего фрагмента хлорангидрид Tos-пироглутаминовой кислоты конденсировался с аспара ином после удаления Tos-группы с помощью Na/NH^ свободный пептид

I

Cyi

2

Туг

Э

He

4

Cln

5 Am

Tos -OH H

TospGloCI H--OH Z

TospGli

Tos- -OH Tos.

6 Cys

z- 4ci

Z- - CI

OH z юн H

ЮН

OH H

Pro Leu Z4-OH H-

Cys — Туг - He — Gin — Asn — Cys - Pro — Leu Gly -

9

157 Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

Рис. 81. Схема синтеза окситоцина В. Дю Виньс

I 10 I

5 Glr-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyi I

Glu I

Val I

lie I

Cly

15 21 -Gin—Leu—Glu—A fn—Туг—Су I—Aw

S His-]

Gin I

Asn I

Val I

Phe

10 IS / 20

Leu-Cyi-Gly-Ser-Hii-Leu-Vel-Glu-Ale-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu

]

Arg

25 Gi»

Thf-Lys-Pro-Thr-Tyr-Pbe-Phe

158 H—Gin—Asn—ОН обрабатывался Tos—lie—CI. Оба блока

- соединялись тетраэтилфосфитом в диэтилфосфите в защищенный

Белки и пептиды гептапептид 3 — 9, который затем подвергался обработке Na/NH|,

бензилировался и конденсировался с N концевым дипептидом Z—Cys(Bzl)—Туг—ОН. Затем нонапептид деблокировался Na/NH3, окислялся кислородом воздуха для создания дисульфидной связи и очищался противоточным распределением. В результате был получен синтетический окситоцин, идентичный природному.

Успешные синтезы 39-членного пептида кортикотропина (вернее, его аналога, так как структуру АКТГ уточнили в 1971 г.) и его фрагментов (Р. Швицер, П. Зибер, 1963) позволили вплотную приступить к исследованиям по синтезу инсулина. В 1960 г. удалось соединить две разрозненн

страница 21
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.08.2017)