Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

ледние годы большое распространение получили активированные эфиры на основе производных гидроксилами на и прежде всего N гидроксисукцинимидные эфиры, например:

R I

X—NH—СН—СООН

HONSU

R I

-сн-

-COON

о

-NH—CHR—СО ONSu

Разновидностью метода активированных эфиров является конденсация с помощью дицикло к илкарбодиимида а присутствии добавок — п нитрофенола, N-гидроксисукцинимида, 1-гидрокси-бензотриазола (НОВО или пеитафторфенола; часто в этом случае используется так называемый «F-комплекс», состоящий из трех молекул пентаерторфенола и одной молекулы дициклогексилкарбо-

Кишфалудн IKIsfaiudy) Лайош (р. 1924). венгерский химик-органик. Окончил Будапештский технический университет (1948), с 1956 г. возглавляет исследовательскую лабораторию фармацевтической фирмы «Гедеон Риитер» Основные работы посвящены химии пептидов. Предложил применить высоко pea к ц и о н неспособны е пен та фто р фениловые эфиры для синтеза пептидов в растворе.

142

Бепки и пептиды

Шнвн |Sheehan) Джон Нлврк (р. 1915), американский химик-органик. Окончил Мичиганский университет (1941), в 1952—1971 гг.-— профессор Массачу-сетского технологического института в Кембридже (США), Основные работы посвящены синтетической органической химии. Разработал нврбоднимид ный метод синтеза пептидов (1955— 1958). Синтезировал пенициллин (1957). Исследовал структуру ряда важных антибиотиков.

диимида. Специально можно отметить конденсацию с помощью дициклогексилкарбодиимида и 1-гидроксибензотриазола, которая позволяет получать продукты высокой степени оптической чистоты, в том числе и в случае производных гистидина (что обычно трудно достигается другими методами).

Карбодиимидный метод. Дициклогексилкарбодиимид предложен в 1955 г. Дж. Шиэном и Г. Хессом при синтезе пенициллина (см. с. 724). Первой стадией реакции является активнроаание карбоксильного компонента путем образования реакциоинеспособного производного 0-ацилизомочевины.

К—NH—СН—СО—О—С

9

6

99

- х—NH—СН—CON—СО—NH

Производное О-ацнлизомочеаииы превращается в пептид непосредственно или через соответствующий симметричный ангидрид. Главным побочным процессом является О —*¦ N-ацильный сдвиг, приводящий к получению нереакционноспособных побочных продуктов — N-ацил изо моче вин.

X—NH—СН—СООН + ^ У~ N=C=N—^ ^ ——-

R 1

X—NH—СН—СО—О—С

О-Ацилизомочввиня

9-

^N

6

К R

i_i (j_r-yj_СО_V ^ вввввВвввШ I

—-»-Х—NH—СН— CONH -СН—СО—Y + CO(NH—С,.Н,,Ь

Дициилогекс и лм очввина

О Ацилизомочевина способна перегруппировываться лон, что также приводит к рацемизации (см. с. 144)

оксазо-

143

Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

О N—С,,Н,

* , II II

R—СО—NH—CHR—С—О—С

I

NHCHi I

R—С + (С.Н.,— NH),CO

JJ5(4H)-0

ксйэогон

HVN—CHR2CO—Y

- R—CO—NH—CHR1—CONH—CHRaCO—Y Смесь >пии po

В настоящее время широко применяются так называемые водорастворимые карбодиимиды: 1 этил (3 диметиламииопропил) кар бодиимид, п-толуолсульфонат( 1-циклогексил-3-(2-метилморфоли-ноэти ) карбодиимида и др.

СН СН2—N = C'^N'—СНаСНа—СН2—N(CH3)2

О

СНЭ

rC=N—СНдСНэ—N*~^) . СНэС6Н,50э

Поразительно, что в этом случае речь идет о водоотнимающих реагентах, успешно функционирующих и в водных растворах.

Карбоксиангидридныи метод. В 1966 г. Р. Хиршман предложил использовать для направленного синтеза пептидоа в водной среде N карбоксиангидриды (NCA, ангидриды Лейкса, оксазолидин-дионы).

Суть предложенного им приема заключается в точном регулировании рН среды: конденсация N карбоксиангидрида с аминокислотой проводится при рН 10,2, при подкислении осуществляется N декарбоксилирование производных карбаминовой кислоты, и затем цикл реакций повторяется (иногда такой прием обозначается

144

Белки и пептиды

как «рН-весы»|. Этим методом, в котором построение цепи ведется от С- к N-концу, Р. Хиршман получил весьма длинные пептидные фрагменты S белка рибонуклеазы (см. с. 191).

R I ' л R R

Н N—сн—соон -ООС—NH—СН— CONH —СН—соо

HN-

R о=с

R

-»H2N—CH— CONH -CH—СООН -—-»OOC—NH—CH— CONH —CH— CONH — CH—COO~-

PH 10,0

Ra R R

I I I

H?N—CH— CONH -CH— CO*"' —CH—COOH

Рацемизация, т. е. полная или частичная потеря оптической чистоты одного или более аминокислотных остатков, является [лавной побочной реакцией в пептидном синтезе, накладывающей жесткие ограничения на выбор защитных групп и методов конденсации. Рацемизация приводит к образованию оптически неоднородных продуктов, разделение которых по мере удлинения цепи резко осложняется и превращается в практически неосуществимую задачу.

Реакция рацемизации протекает по двум механизмам: 1) через образование М4Н)-оксазолоиов (часто называемых азлактонами) или 2) через енолизацию:

О

II Н -R _^N. Н -N.

Н О ^О он 5(4Н) - Оиизолон

R R

*1 /V I /V

2) X—N — СН—СГ -J— X — N—С=С' —"-Рацемат

| | ^он

н н

В общем случае степень инверсии у а-угле родного атома (рацемизации) определяется природой заместителей X. R. Y. температурой и рН среды.

Аминокислоты и их неактивироваины производные заметно рацемизуются в сильнокислой или щелочной среде, особенно при нагревании. Активированные производные аминокислот более подвержены рацемизации как в процессе их получения, так и в ходе амииолнза. Особенно легко рацемизуются производные пептидов, что осложняет проведение конденсации фрагментов. Следует отметить, что уретановые N-защитиые группировки аминокислот (в том числе наиболее популярные Z- и Вое-группы) обладают низкой склонностью к образованию оксазолоиов. Поэтому ступенчатый синтез с использованием этих групп — один из наиболее надежных путей избежать рацемизации при синтезе пептидов.

Синтез на полимерном носителе. Пептидный синтез в классическом варианте сопряжен со значительными затратами труда и времени. С целью создании более эффективной методологии Р. Мер-рифилд в 1963 г. предложил твердофазный метод синтеза пептидов. Идея его состоит в закреплении растущей полипептидной цепи на полимерном нерастворимом носителе. При этом значительно упрощаются операции выделения промежуточных продуктов, которые сводятся к экстракции и фильтрованию полимера, полиостью снимается проблема нерастворимости пептидов и создаются предпосылки для автоматизации процесса. Определяющим фактором в твердофазном синтезе является полнота протекания всех химических реакций, которая достигается за счет применения избытка конденсирующего агента и N защищенной аминокислоты, отделяемых экстракцией. Естественно, выбор защитиык группировок и методов конденсации должен обеспечить полное отсутствие рацемизации. Наилучшие результаты достигаются при использовании

1. Получение полимера с активной группи-

145

Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

Меррмфнлд IMerrlfleld) Роберт

(р. 1921), американский химик-биоорганик Окончил Калифорнийский университет в Лос-Анжелесе (1943), с 1966 г.— профессор Рокфеллеровского университета (Нью-Йорк). Разработал известный метод твердофазного синтеза пептидов (1962) и осуществил синтез брадикинина, ангиотенэина и рибонуклеазы. Лауреат Нобелевской премии по химии (1984).

Рис. 77. Схема твердофазного синтеза пептидов.

х_сн2—J

2. Присоединение первой (С - концевой) N за

щищенной аминокислоты

(и промывка с целью удаления примесей)

4. Конденсация со второй N защищенной аминокислотой (например DCC)

3. Удаление N защитных групп (Вое, Ddz и т. п.), например с помощью CF СООН СНгС!

5. Удлинение цепи (повторение стадий 3 и 4 g< к

6. Отщепление синтезированного пептида (на-

пример, HBr CF СООН) от полимера, дебло-

кирование и очистка

R1 R2 R' R

I I H2N—СН— CO---NH —СН- СО—NH —СН— СО—NH -СН—СООН

Белки и пептиды

Хнршман |Hlrichman| Pan ф Ф.

(р. 1922), американский химик-органик. Окончил Висконсинский университет (1948), работает в исследовательской лаборатории фирмы «Мерк». Известен работами по синтезу пептидов и выяснению связи между структурой и функцией пептидных гормонов (ти-ролиберин, соматостатин). Применил N карбоксиангидридь для направленного синтеза пептидов.

Вое-. Врос- и Fmoc-защитных групп, методов симметричных ангидридов и дицик огексилкарбодиимидного Успешное проведение синтеза на твердом полимере требует применения высокоочищен иых реагентов и растворителей на всех стадиях процесса. Первый твердофазный синтез гормона брадикинина был проведен Р. Мер рифи дом с общим выходом 70%.

В качестве носителя наиболее широко используется микропористый хлорметилиро ванный сополимер стирола и дивинил бензола, хорошо набухающий в органических растворителях и обладаюший химической и механической прочностью.

Нагрузка полимера растущими пептидными цепями, как правило, невелика и составляет 0,1 — 0,3 ммоля пептида на 1 г полимера. Полнота реакции ацилирования оценивается на основании реакции с нингидрином или флуорескамином (см. с. 35 и 36) или физико-химическими методами.

С целью повышения кислотоустойчивое™ «якорных» группировок, связывающих пептид с полимером, в настоящее время применяются полимерные смолы с фенилацетамидометильными группами (Раш полимеры)

R—С—О—СН.—/ V- СН — СО—NH—СН — #М II

Отщепление пептида от смолы проводится с помощью жидкого HF в присутствии анизола, раствора HF в пиридине, трифторметан-сульфокислоты, реактива Плесса l(CF3COO)3B в CF3COOH|, а так-

Рис. 78. Твердофазный синтезатор пептидов 990 же HBr/CF^COOH и других реагентов; иногда применяется аммо иолиз, гидразинолиз, омыление и т. п.

Автоматический твердофазный синтез пептидов осуществляется на специальных приборах, называемых синтезаторами (рис. 78).

В последние годы создан колоночный вариант твердофазного синтеза пептидов. В качестве матрицы вначале использовалась полярная полиамидная смола- Этот желатинообразный полимер хорошо проницаем и сольва тируете я многими растворителями, включая воду и ди метил формам ид. Мягкие полимеры такого типа в колоночном варианте имели неудовлетворительные физико-химические и механические свойства. Р. Шеппард и сотр. предложили использовать жесткий макропористый неорганический носитель — силикагель, в порах которого заполимеризован пол иди метила кри л амидный гель. Этот носитель, сочетающий в ceQe свойства жесткой матрицы и хорошо набухающего органического геля, нашел успешное применение в колоночном твердофазном синтезе. На его основе создан и синтезатор колоночного типа.

Жидкофизный способ синтеза пептидов предусматривает использование в качестве носителей растворимых полимеров (М. М. Шемякин, 1965). Одним из недостатков твердофазного синтеза является изменеиие степени набухания полимера по мере роста пептидной цепи, которое может приводить к периодическому «маскированию» концевых NH^-групп растущей пептидной цепи. Это, в свою очередь, вызывает неполное протекание реакций конденсации на той или иной стадии, и в результате образуются «ложные пептиды», т. е. пептиды с пропуском отдельных аминокислотных остатков. Разделение смеси пептидов иа конечном этапе синтеза в этом случае оказывается затруднительным. При жидкосраз-ном способе пептидного синтеза на полимере снимаются некоторые осложнения вызываемые гетерогенностью среды.

В качестве растворимого полимера используется полистирол (молекулярная масса около 200 ООО), а избыток реагентов удаляется осаждением полимера из органического раствора с последующим фильтрованием. Лучшие результаты получены при применении в качестве носителей поли этилен гли колей с молекулярной массой 2000 — 20 000 и блок-сополимеров полиэтиленгликоля с диизоциа-натами (Э. Байер, 1978).

Н—[(О—СН2СН,)т— ОСО—NH—-r^fl— NH—СО—]л— ОСНгСгЬ—ОН

Жидкофазный способ синтеза пептидов используется в некоторых типах автоматических синтезаторов для получения относительно небольших пептидных молекул (в случае высокомолекулярных пептидов синтез нередко осложняется из-за изменения растворимости полимера).

Завершая обсуждение методов синтеза пептидов на полимерном носителе, отметим возрастающую роль полимерных реагентов. В частности, часто применяются полимерные активированные эфи-

147

Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

Байер |Вауег| Эрнст (р. 1927), немецкий химик. Окончил Гейдельбергский университет (1954), с 1962 г.— профессор университета и директор Института органической химии ¦ Тюбингене. Известен работами по структуре ме-таллопротеинов и синтезу полипептидов на полимерных носителях.

СН3С1

148

Белки и пептиды

ры защищенных аминокислот типа нитрофениловых, N-гидро-ксисукцииимидных, 1-гидроксибензотриазоловых (А. Патчорник, Т. Виланд).

[—СН.—СН—]„

|_СН,-СН-]„

1

СО—CHR—NH—X

[—СН—СН—]п

0ЖкД*-о I

С О—С HR—N Н— X

N—ОСО—CHR—NH—X /

= |Ala)-ONp

Boc-(Vai)-ONp/ р

Принципы метода изложены на рисунке 79. Аминокомпонент пропускается через колонки с полимерными активированными эфи-рами различных защищенных аминокислот в заданной последовательности, определяемой структурой синтезируемого пептида. Если в качестве носителя используется полимер на основе полиэтилен-гликоля, получаются растворимые полимерные активированные эфиры (М. Муттер, 1977).

Полимерные реагенты применяются и в синтезе циклических пептидов, побочная реакция олигомеризации, протекающая обычно вследствие межмолекулярной конденсации, в этих условиях не происходит:

R R R °>N

I I I

X—NH—СН—СО—(—NH—СН—СО—)n—NH—СН—СО—О—Р ^\

I I I

H.N— СН—СО—(—NH—СН—СО—)n—NH— СН—СО

'l Циклизация

r r r

I I I

NH— СН—СО—(— NH— СН—СО—)n— NH—СН I_

OjN

—со -I- но—Р

^^^Г^^~^- Синтез поднаминокнсдот. Как уже отмечалось (с. 127), для

ванных эфиров аминокислот синтеза полиамииокислот лучше всего использовать N карбоксиан-

гидриды. Если последние являются достаточно стабильными, для ускорения реакции применяют инициаторы (спирты, амины и др.), например:

149

Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

HN-/ HN _ |

---¦¦- ООС—NH—СН—СО—N

О^О'Чо

с " >•

О**5" ^

R

-H2N—СН—СО—NT -ям- НзЫ—СН—CONH—СН—СО—N

R1 -COj ^R'

R R R

- HjN—CH—CO(—NH—CH—CO—)„NH—CH—CO— N^r1 Поликонденсацня

В случае смеси двух N-карбоксиангидридов образуется сополимер аминокислот. Распределение аминокислот в цепи при этом оказывается не статистическим, а определяется природой аминокислот. На основе тех же принципов могут быть получены полимеры, состоящие из повторяющихся коротких последовательностей аминокислот. В частности, при поликонденсации с помощью различных методов линейных ди-, три-, тетра- и пентапептидов образуются соответствующие регулярные полипептиды из 30 — 50 повторяющихся единиц:

R R1 R2

I I I

H(~NH—СН—СО—NH—СН—СО—NH—СН—СО—)пОН

Ферментативный синтез пептидов и белков. Сложность и трудоемкость синтеза пептидов с помощью химических методов настоятельно побуждают искать принципиально иные подходы к синтезу пептидно-белковых веществ. Одним из таких подходов является синтез пептидов с использованием в качестве катализаторов ферментов. Еще в 1937 г. М. Бергманн, Г. Френке ь Конрат и Дж. Фру-тон впервые сообщили о возможности обращения протеолитической реакции в сторону образования пептидной связи, однако лишь недавно были

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(29.04.2017)