Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

ат Международной Ленинской премии «За укрепление мира между народами» (1953).

Четвертичная структура белков

Многие белки состоят из субъединиц, одинаковых или различных, образующих трехмерные ассоциаты или более сложные ансамбли. В этом случае принято говорить о четвертичной структуре белков. Специфичность четвертичной структуры данного белка обусловливается выполняемой им биологической функцией, а взаимодействие субъединиц обеспечивает дополнительный механизм ее регуляции.

Термин «четвертичная структура» был предложен в 1958 г. английским кристаллографом Дж. Бернатом как необходимое дополнение к принятому понятию о первичной, вторичной и третичной структурах белка (К У Линцерстрём Ланг Л П линг. 1952). Однако субъединицы в составе белков были обнаружены с помощью седиментацнонного метода еще в 1926—1929 гг. Т. Сведбергом, который считал, что все белки построены из определенного числа небольших стандартных субъединиц. В 1965 г. Ж. Mono предложил понятие протомер для наименьшей структурной

118

Белки и пептиды

единицы сложного белка, формирующей путем ассоциации с целым числом идентичных единиц (одной или несколькими субъединицами) полную четвертичную структуру белка. Например, в белке из 6 одинаковых субъединиц (сц) про. оме м является мономер (а), а в белке из двух типов субъединиц <а,,0в) протомер имеет состав (зф). Детальное изучение четвертичной структуры белков началось, по существу, с работ М. Перутца и Дж Кендрью по гемоглобину (конец 50-х годов).

Сведберг (Svedberg) Теодор

(1884—1971), шведский физиисхимик иностранный член АН СССР (1966). Окончил Упсальский университет (1907), с 1921 г.— профессор Упсаль-ского университета. Основные работы — в области коллоидной химии, определения размеров и форм молекул. Создал метод ультрацентрифугирования (1919) и впервые построил ультра центрифуги для исследования высоко-дисперсных золей. С помощью зтого метода определил молекулярную массу гемоглобина и других белков. Лауреат Нобелевской премии по химии (1926).

Первый этап исследования четвертичной структуры белка — анализ его субъединичного состава. Для этого необходимо провести диссоциацию белка на отдельные субъединицы, что обычно достигается с помощью гидрохлорида гуанидина, мочевины или додецил-сульфата натрия (с добавлением меркаптоэтанола для восстановления дисульфидных саязей). Во многих случаях диссоциации способствуют изменение рН среды, добавление соли, замена воды на органические растворители, а также химическая модификация белка. Субстраты, различные метаболиты и кофакторы в разных белках влияют как на ассоциацию, так и диссоциацию субъединиц. Субъединичный состав белка может быть выяснен путем сопоставления его суммарной молекулярной массы с молекулярными массами отдельных субъединиц (установленными с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), а также с числом N- и С-концевых аминокислотных остатков. Другой метод анализа заключается в сравнении числа пептидов (N), ожидаемых на основании данных аминокислотного состава, с числом реально образующихся при том или ином специфическом гидролизе молекулы белка. Пример подобного рода анализа триптических гидролиэатов субъединичных белков методом пептидных карт приведен на рисунке 69.

Две

одинаковые субьединицы

\ 20OQU 20^10 1

Четыре

п.. пари одинановые "уоь единицы

Рис. 69. Анализ субъединичной структуры белка методом пептидных карт.

1 л /

Процесс формирования четвертичной структуры белков проходит в соответствии со строгими законами термодинамики. Силы, способствующие ассоциации белка, должны быть скомпенсированы таким образом, чтобы активные группировки, расположенные в областях, имеющих тенденции к ассоциации, не оставались экспонированными наружу. В белках, построенных из одинаковых субъединиц, последние практически всегда находятся в эквивалентном (или идентичном) окружении. На рисунке 70 представлены возмож-

119

Строение белков и пептидов

ввЖнШТвМ V

11ентамер

Рис. 70, Пространственные формы белков, состоящие из идентичных субъ-еди ниц.

Рис. 71. Четвертичная структура окси-гемоглобина

120 ные пространственные формы белков, состоящих из разного числа

--(до б) идентичных субъединиц. Для ди-, три- и пентамеров а каждом

Белки и пептиды случае имеется только одна форма, причем следует подчеркнуть,

что олигомерные белки с нечетным числом субъединиц крайне редки. У тетрамеров существует две формы — квадрат и тетраэдр, а у гексамеров — три формы (трехгранная призма, шестиугольник и октаэдр).

Рис. 72. Электронная микрофотография глутамин интетазы E.coli.

Рис. 73. Модель четвертичной структуры глутаминд.интетазы Е. coli.

Взаимодействие между комплементарными участками субъединиц в четвертичной структуре осуществляется с помощью ван-дер-ваальсоаых сил, ионных и водородных связей.

Формирование четвертичной структуры из трех и более субъединиц протекает с промежуточным образованием агрегатов меньшего размера. Агрегация первых мономеров часто облегчает присоединение последующих—в этом смысле образование четвертичной структуры является кооперативным процессом.

Имеется ряд физико-химических методов исследования геометрии субъединиц в белках, обладающих четвертичной структурой. Наиболее информативный среди них — метод рентгеноструктурно-го анализа. Классическими являются рентгеноструктурные исследования гемоглобина, проводившиеся в Кембридже М. Перутцем и сотр. в течение 25 лет. начиная с 1937 г. Была установлена субъединичная структура гемоглобина — сх.*р». С каждой субъединицей связано по одной гем-группе (см. с. 205), атом железа которой может обратимо саязывать молекулу О На рисунке 71 представлена четвертичная структура оксигемоглобина Можно видеть, что контакты образуются преимущественно между а- и р и в меньшей степени между а—а- и р—р-ц<*пями белка. Большинство контактов возникает за счет взаимодействия гидрофобных боковых цепей аминокислотных остатков, часть из них обусловлена водородными и электростатическими связями.

Электронная микроскопия — информативный метод анализа четвертичной структуры белков, особенно крупных молекул со многими субъединицами. Главные ограничения метода — сравнительная «прозрачность» белков по отношению к пучку электронов и их недостаточная стабильность в условиях эксперимента. Обычно

удается проводить структурный анализ с разрешением до 121

2 нм, а при соблюдении определенных предосторожностей — до----¦

I нм. На рисунке 72 представлена электронная микрофотография Строение белков и пептидов глутаминсиитетазы E.coli — фермента, осуществляющего синтез глутамина из глутаминовой кислоты, (МН/ и АТР и играющего ключевую роль в метаболизме азота. Глутаминсинтетаза состоит из 12 идентичных субъединиц с молекулярной массой 50 ООО каж-

Рис. 74. Модель четвертичной структуры аспартат-транскарбамоилазы.

дая, уложенных в два параллельных гексагональных кольца. На рисунке 73 изображена пространственная модель фермента, полученная на основании данных электронной микроскопии.

Совместное использование электронной микроскопии и рентге-ноструктурного анализа дало возможность установить четвертичную структуру еще более сложно устроенного фермента — аспартат-транскарбамоилазы E.coli, катализирующего основную реакцию в биосинтезе пиримидиновых нуклеотидов — образование N-карба-монласпарагиновой кислоты из аспарагиновой и кврбамоилфосфор-ной кислот. В состав ферменте входит 12 субъединиц — б каталитических (С-субъединицы) и б регуляторных (R-субъединицы) с молекулярными массами 33 500 и 17 ООО соответственно. Согласно пространственной модели (X. Шахман 1972), С-субъединицы объ единены в тримеры, расположенные один над другим, а R-субъеди-ницы находятся на периферии молекулы, взаимодействуют друг с другом и с С-субъединицами (рис. 74).

Для исследования четвертичной структуры белков широко используется химическая модификация, в частности, бифункциональными реагентами (см. с. 168). С помощью такого подхода была изучена пространственная структуре ДНК-зависимой РНК-полиме-разы E.coli, состоящей из пяти субъединиц (две идентичные а-субъ-единицы по 36500, fti, р' и ft-субъединицы — 150 000, 155 000 и 70 000 соответственно). Проводилась модификация бифункциональными реагентами как самого фермента, так и его комплекса с фраг меитами ДНК-матрицы, содержащими промоторные участки. В последнем случае использовались фрагменты ДНК, несущие фоточувствительные группировки (частично депуринизованные или содержащие остатки 5-бромурацила). На основании этих данных была

Перутц 1Peruli| Макс Фердинанд

(р. 1914), английский биохимик. Окончил Венский университет (1936), с 1962 г.— руководитель лаборатории молекулярной биологии Кембриджского университета. Расшифровал с помощью рентгеноструктуриого анализа пространственное строение молекулы гемоглобина и предложил ее модель (1960). Лауреат Нобелевской премии по химии (1962, совместно с Дж. Кендрью).

122 предложена пространственная модель расположения субъединиц

--РНК-полимеразы в бинарном комплексе с промоторным участком

Белки и пептиды дНК (А. Д. Мирзабеков. 1981) (рис. 75).

Возникает вопрос: почему многие белки состоят из субъединиц? Какие преимущества это дает по сравнению с одной длинной пептидной цепью? Во-первых, наличие субъединичной структуры позволяет «экономить» генетический материал. Для оли го мерных белков, состоящих из идентичных субъединиц, резко уменьшается размер структурного гена и соответственно длина матричной РНК.

Во-аторых, при сравнительно небольшой величине цепей уменьшается влияние случайных ошибок, которые могут возникнуть в процессе биосинтеза белковых молекул. Кроме того, возможна дополнительная выбраковка «неправильных», ошибочных полипептидов в процессе ассоциации субъединиц в единый комплекс.

В-третьих, наличие субъединичной структуры у многих белков позволяет клетке легко регулировать их активность, например, путем смещения равновесия ассоциация — диссоциация в ту или иную сторону.

Наконец, субъединичная структура облегчает и ускоряет процесс молекулярной эволюции. Мутации, приводящие лишь к небольшим конформационным изменениям на уровне третичной структуры за счет многократного усиления этих изменений при переходе к четвертичной структуре, могут способствовать появлению у белка новых свойств.

Характерной особенностью белков с четвертичной структурой является их способность к самосборке. Легко происходит, например, самосборка гемоглобина из смеси а- и р1-цепей. Таким образом, в аминокислотной последовательности полипептидных цепей олиго-мерного белка закодированы как бы два уровня информации: один

Рис. 75. Пространственная модель комплекса РНК-полимеразы Е. coli с фрагментом ДНК-матрицы. Цифрами обозначены местоположения нуклеотидных звеньев вдоль цепи ДНК (отсчет от точки инициации транскрипции).

из них определяет трехмерную структуру отдельных полипептидных 1 23

цепей, а второй, поскольку каждая субъединица содержит специ- -

фические участки связывания с другими субъединицами, опреде- Строение белков и пептидов

ляет четвертичную структуру всей многокомпонентной молекулы в

целом.

Крупные надмолекулярные белковые комплексы являются само организующимися системами. Характерный пример такого рода — система синтетаз жирных кислот (из дрожжей), состоящая из 7 различных ферментов. Каждый из этих ферментов, в свою очередь, построен из 3-х, по-видимому, идентичных субъединиц. Показано, что по отдельности все компоненты системы неактивны, но при их смешении образуется активный мультиферментный комплекс (Ф. Линен, 1964).

Высокая способность к самоорганизации присуща таким надмолекулярным системам, как вирус табачной «мозаики (ВТМ) и рибосома (см. с. 403). Частица ВТМ построена из 2130 идентичных белковых субъединиц (каждая из которых содержит 158 аминокислотных остатков) и одной цепи РНК длиной около 6400 нуклеотидов. X. Френкель-Конрат в L962 г. получил активные вирусные частицы, способные заражать растения табака, при смешении очищенных субъединиц белка оболочки и молекулы вирусной РНК.

Электронно-микроскопические исследования позволили установить последовательность реконструкции вирусных частиц (рис. 76). Субъединицы образуют двойной диск с 17-кратной вращательной симметрией, который присоединяется к молекуле РНК ВТМ у ее 3 конца Последующие субъединицы полимеризуются на этом диске, наращивая спираль (16 /л субъединицы на один оборот) до тех пор, пока не закроется 5'-конец РНК ВТМ.

Химический синтез и химическая модификация белков и пептидов

Химический синтез пептидов и белков

Пептидный синтез — это построение пептидной цепи путем соединения аминокислот с помощью химических методов. Обычно речь идет о получении пептидов, содержащих до 40 — 45 аминокислот, таким способом можно осуществить синтез и небольших белков.

Пептидный синтез служит надежным средством доказательства строения природных пептидно-белковых веществ. Синтетические пептиды широко используются для структурно-функциональных исследований. С помощью химических методов удается получать аналоги биологически активных пептидов, в том числе циклические производные с заданными свойствами (например, с пролонгированным, усиленным или избирательным действием), а также аналоги с остатками небелковых аминокислот. Синтетические пептидные фрагменты белков применяются для изучения их антигенных свойств и получения специфичных к отдельным участкам полипептидных цепей антител, используемых в структурно-функциональном анализе и в создании диагностику мои и вакцин. Методами пептидного синтеза получаются (в том числе и в промышленном масштабе) многие практически важные препараты для медицины и сельского хозяйства.

Исторический очерк. Первое производное пептида было получено синтетически в 1882 г. Т. Курциусом при обработке серебряной соли глицина бе нзои л хлоридом, в продуктах ревкции наряду с другими соединениями был обнаружен кристаллический N-бензоилглицил-глицин. Однако «отцом пептидного синтеза» считают Э. Фишера, впервые получившего в 1901 г. свободный глицилглицин при частичном гидролизе дикетопиперазииов (последние легко образуются из эфиров аминокислот). Э. Фишер первым понял значение пептидного синтеза как средства доказательства строения белка и необходимость разработки специфических методических приемов.

Т. Курциус не признавал приоритета Э. Фишера и в 1902 г., вновь обратившись к проблеме пептидного синтеза, предложил

СзНьВг МНЭ— NHj

Сег-ЦСО—NH—СН2—СООН -CeHsCO—NH—СНа— СООСаНв -

Ад-соль

HNOa

СеН5СО—NH—СН2—СО—NH—NH2 -С6Н^СО—NH—СН2—СО—N |— -

NHjCHaCOOH

---СrH СО—NH—CHi—СО—NH—СНэ— С ! >ОН -»- и т. д.

NeOH. НаО

124

Белки и пептиды

эффективный метод конденсации, основанный на использовании азидов аминокислот. Метод состоял в превращении N-бензоилгли-цина в этиловый эфир, затем в гидразид обработкой гидразином и далее в азид с помощью азотистой кислоты. Peaкционнеспособный азид легко реагировал с глицином или глицилглицином. Таким способом были получены пептиды, содержащие до 7 аминокислотных остатков, однако се

страница 17
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.08.2017)