|
|
Биоорганическая химияат Международной Ленинской премии «За укрепление мира между народами» (1953). Четвертичная структура белков Многие белки состоят из субъединиц, одинаковых или различных, образующих трехмерные ассоциаты или более сложные ансамбли. В этом случае принято говорить о четвертичной структуре белков. Специфичность четвертичной структуры данного белка обусловливается выполняемой им биологической функцией, а взаимодействие субъединиц обеспечивает дополнительный механизм ее регуляции. Термин «четвертичная структура» был предложен в 1958 г. английским кристаллографом Дж. Бернатом как необходимое дополнение к принятому понятию о первичной, вторичной и третичной структурах белка (К У Линцерстрём Ланг Л П линг. 1952). Однако субъединицы в составе белков были обнаружены с помощью седиментацнонного метода еще в 1926—1929 гг. Т. Сведбергом, который считал, что все белки построены из определенного числа небольших стандартных субъединиц. В 1965 г. Ж. Mono предложил понятие протомер для наименьшей структурной 118 Белки и пептиды единицы сложного белка, формирующей путем ассоциации с целым числом идентичных единиц (одной или несколькими субъединицами) полную четвертичную структуру белка. Например, в белке из 6 одинаковых субъединиц (сц) про. оме м является мономер (а), а в белке из двух типов субъединиц <а,,0в) протомер имеет состав (зф). Детальное изучение четвертичной структуры белков началось, по существу, с работ М. Перутца и Дж Кендрью по гемоглобину (конец 50-х годов). Сведберг (Svedberg) Теодор (1884—1971), шведский физиисхимик иностранный член АН СССР (1966). Окончил Упсальский университет (1907), с 1921 г.— профессор Упсаль-ского университета. Основные работы — в области коллоидной химии, определения размеров и форм молекул. Создал метод ультрацентрифугирования (1919) и впервые построил ультра центрифуги для исследования высоко-дисперсных золей. С помощью зтого метода определил молекулярную массу гемоглобина и других белков. Лауреат Нобелевской премии по химии (1926). Первый этап исследования четвертичной структуры белка — анализ его субъединичного состава. Для этого необходимо провести диссоциацию белка на отдельные субъединицы, что обычно достигается с помощью гидрохлорида гуанидина, мочевины или додецил-сульфата натрия (с добавлением меркаптоэтанола для восстановления дисульфидных саязей). Во многих случаях диссоциации способствуют изменение рН среды, добавление соли, замена воды на органические растворители, а также химическая модификация белка. Субстраты, различные метаболиты и кофакторы в разных белках влияют как на ассоциацию, так и диссоциацию субъединиц. Субъединичный состав белка может быть выяснен путем сопоставления его суммарной молекулярной массы с молекулярными массами отдельных субъединиц (установленными с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), а также с числом N- и С-концевых аминокислотных остатков. Другой метод анализа заключается в сравнении числа пептидов (N), ожидаемых на основании данных аминокислотного состава, с числом реально образующихся при том или ином специфическом гидролизе молекулы белка. Пример подобного рода анализа триптических гидролиэатов субъединичных белков методом пептидных карт приведен на рисунке 69. Две одинаковые субьединицы \ 20OQU 20^10 1 Четыре п.. пари одинановые "уоь единицы Рис. 69. Анализ субъединичной структуры белка методом пептидных карт. 1 л / Процесс формирования четвертичной структуры белков проходит в соответствии со строгими законами термодинамики. Силы, способствующие ассоциации белка, должны быть скомпенсированы таким образом, чтобы активные группировки, расположенные в областях, имеющих тенденции к ассоциации, не оставались экспонированными наружу. В белках, построенных из одинаковых субъединиц, последние практически всегда находятся в эквивалентном (или идентичном) окружении. На рисунке 70 представлены возмож- 119 Строение белков и пептидов ввЖнШТвМ V 11ентамер Рис. 70, Пространственные формы белков, состоящие из идентичных субъ-еди ниц. Рис. 71. Четвертичная структура окси-гемоглобина 120 ные пространственные формы белков, состоящих из разного числа --(до б) идентичных субъединиц. Для ди-, три- и пентамеров а каждом Белки и пептиды случае имеется только одна форма, причем следует подчеркнуть, что олигомерные белки с нечетным числом субъединиц крайне редки. У тетрамеров существует две формы — квадрат и тетраэдр, а у гексамеров — три формы (трехгранная призма, шестиугольник и октаэдр). Рис. 72. Электронная микрофотография глутамин интетазы E.coli. Рис. 73. Модель четвертичной структуры глутаминд.интетазы Е. coli. Взаимодействие между комплементарными участками субъединиц в четвертичной структуре осуществляется с помощью ван-дер-ваальсоаых сил, ионных и водородных связей. Формирование четвертичной структуры из трех и более субъединиц протекает с промежуточным образованием агрегатов меньшего размера. Агрегация первых мономеров часто облегчает присоединение последующих—в этом смысле образование четвертичной структуры является кооперативным процессом. Имеется ряд физико-химических методов исследования геометрии субъединиц в белках, обладающих четвертичной структурой. Наиболее информативный среди них — метод рентгеноструктурно-го анализа. Классическими являются рентгеноструктурные исследования гемоглобина, проводившиеся в Кембридже М. Перутцем и сотр. в течение 25 лет. начиная с 1937 г. Была установлена субъединичная структура гемоглобина — сх.*р». С каждой субъединицей связано по одной гем-группе (см. с. 205), атом железа которой может обратимо саязывать молекулу О На рисунке 71 представлена четвертичная структура оксигемоглобина Можно видеть, что контакты образуются преимущественно между а- и р и в меньшей степени между а—а- и р—р-ц<*пями белка. Большинство контактов возникает за счет взаимодействия гидрофобных боковых цепей аминокислотных остатков, часть из них обусловлена водородными и электростатическими связями. Электронная микроскопия — информативный метод анализа четвертичной структуры белков, особенно крупных молекул со многими субъединицами. Главные ограничения метода — сравнительная «прозрачность» белков по отношению к пучку электронов и их недостаточная стабильность в условиях эксперимента. Обычно удается проводить структурный анализ с разрешением до 121 2 нм, а при соблюдении определенных предосторожностей — до----¦ I нм. На рисунке 72 представлена электронная микрофотография Строение белков и пептидов глутаминсиитетазы E.coli — фермента, осуществляющего синтез глутамина из глутаминовой кислоты, (МН/ и АТР и играющего ключевую роль в метаболизме азота. Глутаминсинтетаза состоит из 12 идентичных субъединиц с молекулярной массой 50 ООО каж- Рис. 74. Модель четвертичной структуры аспартат-транскарбамоилазы. дая, уложенных в два параллельных гексагональных кольца. На рисунке 73 изображена пространственная модель фермента, полученная на основании данных электронной микроскопии. Совместное использование электронной микроскопии и рентге-ноструктурного анализа дало возможность установить четвертичную структуру еще более сложно устроенного фермента — аспартат-транскарбамоилазы E.coli, катализирующего основную реакцию в биосинтезе пиримидиновых нуклеотидов — образование N-карба-монласпарагиновой кислоты из аспарагиновой и кврбамоилфосфор-ной кислот. В состав ферменте входит 12 субъединиц — б каталитических (С-субъединицы) и б регуляторных (R-субъединицы) с молекулярными массами 33 500 и 17 ООО соответственно. Согласно пространственной модели (X. Шахман 1972), С-субъединицы объ единены в тримеры, расположенные один над другим, а R-субъеди-ницы находятся на периферии молекулы, взаимодействуют друг с другом и с С-субъединицами (рис. 74). Для исследования четвертичной структуры белков широко используется химическая модификация, в частности, бифункциональными реагентами (см. с. 168). С помощью такого подхода была изучена пространственная структуре ДНК-зависимой РНК-полиме-разы E.coli, состоящей из пяти субъединиц (две идентичные а-субъ-единицы по 36500, fti, р' и ft-субъединицы — 150 000, 155 000 и 70 000 соответственно). Проводилась модификация бифункциональными реагентами как самого фермента, так и его комплекса с фраг меитами ДНК-матрицы, содержащими промоторные участки. В последнем случае использовались фрагменты ДНК, несущие фоточувствительные группировки (частично депуринизованные или содержащие остатки 5-бромурацила). На основании этих данных была Перутц 1Peruli| Макс Фердинанд (р. 1914), английский биохимик. Окончил Венский университет (1936), с 1962 г.— руководитель лаборатории молекулярной биологии Кембриджского университета. Расшифровал с помощью рентгеноструктуриого анализа пространственное строение молекулы гемоглобина и предложил ее модель (1960). Лауреат Нобелевской премии по химии (1962, совместно с Дж. Кендрью). 122 предложена пространственная модель расположения субъединиц --РНК-полимеразы в бинарном комплексе с промоторным участком Белки и пептиды дНК (А. Д. Мирзабеков. 1981) (рис. 75). Возникает вопрос: почему многие белки состоят из субъединиц? Какие преимущества это дает по сравнению с одной длинной пептидной цепью? Во-первых, наличие субъединичной структуры позволяет «экономить» генетический материал. Для оли го мерных белков, состоящих из идентичных субъединиц, резко уменьшается размер структурного гена и соответственно длина матричной РНК. Во-аторых, при сравнительно небольшой величине цепей уменьшается влияние случайных ошибок, которые могут возникнуть в процессе биосинтеза белковых молекул. Кроме того, возможна дополнительная выбраковка «неправильных», ошибочных полипептидов в процессе ассоциации субъединиц в единый комплекс. В-третьих, наличие субъединичной структуры у многих белков позволяет клетке легко регулировать их активность, например, путем смещения равновесия ассоциация — диссоциация в ту или иную сторону. Наконец, субъединичная структура облегчает и ускоряет процесс молекулярной эволюции. Мутации, приводящие лишь к небольшим конформационным изменениям на уровне третичной структуры за счет многократного усиления этих изменений при переходе к четвертичной структуре, могут способствовать появлению у белка новых свойств. Характерной особенностью белков с четвертичной структурой является их способность к самосборке. Легко происходит, например, самосборка гемоглобина из смеси а- и р1-цепей. Таким образом, в аминокислотной последовательности полипептидных цепей олиго-мерного белка закодированы как бы два уровня информации: один Рис. 75. Пространственная модель комплекса РНК-полимеразы Е. coli с фрагментом ДНК-матрицы. Цифрами обозначены местоположения нуклеотидных звеньев вдоль цепи ДНК (отсчет от точки инициации транскрипции). из них определяет трехмерную структуру отдельных полипептидных 1 23 цепей, а второй, поскольку каждая субъединица содержит специ- - фические участки связывания с другими субъединицами, опреде- Строение белков и пептидов ляет четвертичную структуру всей многокомпонентной молекулы в целом. Крупные надмолекулярные белковые комплексы являются само организующимися системами. Характерный пример такого рода — система синтетаз жирных кислот (из дрожжей), состоящая из 7 различных ферментов. Каждый из этих ферментов, в свою очередь, построен из 3-х, по-видимому, идентичных субъединиц. Показано, что по отдельности все компоненты системы неактивны, но при их смешении образуется активный мультиферментный комплекс (Ф. Линен, 1964). Высокая способность к самоорганизации присуща таким надмолекулярным системам, как вирус табачной «мозаики (ВТМ) и рибосома (см. с. 403). Частица ВТМ построена из 2130 идентичных белковых субъединиц (каждая из которых содержит 158 аминокислотных остатков) и одной цепи РНК длиной около 6400 нуклеотидов. X. Френкель-Конрат в L962 г. получил активные вирусные частицы, способные заражать растения табака, при смешении очищенных субъединиц белка оболочки и молекулы вирусной РНК. Электронно-микроскопические исследования позволили установить последовательность реконструкции вирусных частиц (рис. 76). Субъединицы образуют двойной диск с 17-кратной вращательной симметрией, который присоединяется к молекуле РНК ВТМ у ее 3 конца Последующие субъединицы полимеризуются на этом диске, наращивая спираль (16 /л субъединицы на один оборот) до тех пор, пока не закроется 5'-конец РНК ВТМ. Химический синтез и химическая модификация белков и пептидов Химический синтез пептидов и белков Пептидный синтез — это построение пептидной цепи путем соединения аминокислот с помощью химических методов. Обычно речь идет о получении пептидов, содержащих до 40 — 45 аминокислот, таким способом можно осуществить синтез и небольших белков. Пептидный синтез служит надежным средством доказательства строения природных пептидно-белковых веществ. Синтетические пептиды широко используются для структурно-функциональных исследований. С помощью химических методов удается получать аналоги биологически активных пептидов, в том числе циклические производные с заданными свойствами (например, с пролонгированным, усиленным или избирательным действием), а также аналоги с остатками небелковых аминокислот. Синтетические пептидные фрагменты белков применяются для изучения их антигенных свойств и получения специфичных к отдельным участкам полипептидных цепей антител, используемых в структурно-функциональном анализе и в создании диагностику мои и вакцин. Методами пептидного синтеза получаются (в том числе и в промышленном масштабе) многие практически важные препараты для медицины и сельского хозяйства. Исторический очерк. Первое производное пептида было получено синтетически в 1882 г. Т. Курциусом при обработке серебряной соли глицина бе нзои л хлоридом, в продуктах ревкции наряду с другими соединениями был обнаружен кристаллический N-бензоилглицил-глицин. Однако «отцом пептидного синтеза» считают Э. Фишера, впервые получившего в 1901 г. свободный глицилглицин при частичном гидролизе дикетопиперазииов (последние легко образуются из эфиров аминокислот). Э. Фишер первым понял значение пептидного синтеза как средства доказательства строения белка и необходимость разработки специфических методических приемов. Т. Курциус не признавал приоритета Э. Фишера и в 1902 г., вновь обратившись к проблеме пептидного синтеза, предложил СзНьВг МНЭ— NHj Сег-ЦСО—NH—СН2—СООН -CeHsCO—NH—СНа— СООСаНв - Ад-соль HNOa СеН5СО—NH—СН2—СО—NH—NH2 -С6Н^СО—NH—СН2—СО—N |— - NHjCHaCOOH ---СrH СО—NH—CHi—СО—NH—СНэ— С ! >ОН -»- и т. д. NeOH. НаО 124 Белки и пептиды эффективный метод конденсации, основанный на использовании азидов аминокислот. Метод состоял в превращении N-бензоилгли-цина в этиловый эфир, затем в гидразид обработкой гидразином и далее в азид с помощью азотистой кислоты. Peaкционнеспособный азид легко реагировал с глицином или глицилглицином. Таким способом были получены пептиды, содержащие до 7 аминокислотных остатков, однако се |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 |
Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |