Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

гексане.

туру. Примером таких веществ служат аманитины — токсины бледной поганки и апамин —токсин из яда пчелы (см. с. 279).

Исследование пространственной структуры линейных пептидов в связи с уже упоминавшейся конформационной подвижностью является более сложной задачей, чем изучение циклопептидов. Простейшие модели — амиды ациламинокислот в неполярных средах (CCU, гексан) образуют у-изгибы (водородные связи 1) (рис. 61), удлинение цепи сопровождается появлением р"-изгибов (связи 4-^1) (рис. 62). Начиная с 10 — 12-членных пептидов повышается вероятность образования fi структурных ассоциатов и а-спиральных участков, однако переход к водным средам, как правило, разрушает внутримолекулярные водородные связи в коротких пептидах.

Большой интерес вызывает пространственная структура биологически активных олигопептидов. Большинство из них не образует четких пространственных форм в водном растворе. Вместе с тем в ряде случаев прослеживается присутствие свернутых форм со сближенными С- и N-концевыми участками. В неполярных средах или при взаимодействии с матрицей рецептора свернутые формы могут стабилизироваться электростатическими взаимодействиями противоположно заряженных группировок (рис. 63). Для многих биологически активных пептидов — брадикинина, тафцина, энкефа-линов, пептида дельта-сна, фрагментов кортикотропина, мелано тропика и др.— были получены циклические аналоги, в которых свернутые конформацни фиксированы образованием ковалентных связей. Проявление этими аналогами высокой биологической актив-

Рис. 62. Конформация (СН.ЬС— СО D-Pro—Pro—Ala —NHCH. в кристалле.

ности подтверждало, что именно свернутые структуры взаимодей 111

ствуют с биологической мишенью. Такой подход к созданию анало- -

гов биологически активного пептида, учитывающий стереоэлектрои- Строение белков и пептидов

ную структуру молекулы а целом (в противовес локальным изменениям на отдельных участках), получил название топохимического (см. с. 173).

Рис. 63. Образование внутримолекуляр-

ных ионных пар при дегидратации ионо

Методы исследования пространственного строения белков и пептидов в растворе. Конформационные состояния белков и пептидов в растворе исследуются различными методами, каждый из которых имеет свои достоинства и ограничения. Информацию о вторичной структуре можно получить из ультрафиолетовых спектров поглощения в области 180 — 210 нм: как показали исследования регулярных полипептидов (например, полилизина), а спираль имеет меньшее (гипохромизм) а р структура большее (гиперхромизм) поглощение, чем неупорядоченный клубок. В течение долгого времени процентное содержание а-спиральных структур оценивали по кривым дисперсии оптического вращения (уравнение Моф-фита, 1956). В настоящее аремя содержание различных типов аторичных структур определяется из спектров кругового дихроизма (КД) на основе сравнения спектров пептидов и белков с кривыми КД канонических вторичных структур, полученных для регулярных полипептидов (Э. Блоут, 1961) (рис. 64) или выведенных на основе анализа кривых КД ряда белков с установленной пространственной структурой в кристалле.

Инфракрасная спектроскопия (ИК) позволяет надежно различать транс- и цис амидные связи в пептидах: наличие полосы при <--• 1550 см указывает на присутствие транс-пептидных связей, а отсутствие полос в этой области — на цис конфигурацию всех амидиых связей. И К-спектры разбавленных раствороа пептидов в растворителях, не являющихся сильными акцепторами протонов (например, ССЦ или СНС1.0, дают информацию о внутримолекулярных водородных связях: полосы при 3420 — 3480 см~ отвечают свободным, а полосы при 3300—3380 см 1 — водородное вяза иным N Н-группам.

Для количественных оценок различных типов вторичных структур пользуются спектроскопией комбинационного рассеяния, срав

Блоут IBIoutl Элкан Роджерс (р. 1919), американский биохимик, иностранный член АН СССР (1976). Окончил Прин-стонский университет (1939), с 1962 г.— профессор Гарвардского университета, член президиума Национальной Академии наук США. Основные работы — по изучению пространственного строения полипептидов. П рад л ожил двойную спираль для полипептидов ряда грамицидина А

112

Белки и пептиды

fi ;

Жардацми |Jardetzky| Олег (р. 1929), американский фи зи ко х и ми к. Окончил Миннесотский университет (1954); в настоящее время — профессор Оэн-фордского университета (1969), директор Стэнфордской лаборатории ядерного магнитного резонанса. Известен фундаментальными трудами в области ядерного магнитного резонанса биополимеров, в частности белков.

нива я спектр образца с набором реперных спектров, характерных для определенных типов вторичных структур (рис. 65). Преимуществом спектров комбинационного рассеяния является то, что они могут быть сняты как для образцов в твердом состоянии, так и в самых разнообразных растворителях, в том числе в обычной и тяжелой воде. Этот метод дает информацию не только о вторичной структуре, но и об элементвх третичной структуры: о конфигурации дисульфидных связей, участии боковых цепей остатков тирозина в водородных связях, об экспонированном (доступном для растворителя) или спрятанном в белковой глобуле положении остатков триптофана.

Микроокружение аромвтических остатков в белках исследуется методом флуоресценции. Для этих целей используются также анализ спектров КД в области 250 — 300 нм и дифференциальные УФ-спектры, получаемые при изменении рН водной среды, температуры или состава растворителей. По спектрам КД следят за кон формационными превращениями белкоа и пептидов а процессе их функционирования, а также проверяют, сохранилась ли натианая конформация при изменении условий окружающей среды или при химической модификации природного соединения. Для изучения конформацни белков, содержащих парамагнитные центры — такие, как гем в гемоглобине или спиновые метки (различные группы, имеющие неспаре нный электрон), введенные с помощью хи ми

Рис. 64. Спектры КД поли-Ь-лизина в водных растворах в а-спиральной (1), р-струхтурной (2) и неупорядоченной (3) конформациях.

ческой модификации, используется метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Этим методом обычно удается определить ряд внутримолекулярных расстояний, получить сведения о форме молекулы.

Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) при использовании современных подходов позволяет полностью расшифровать пространственное строение пептида или небольшого белка с молекулярной массой до 10 000— 15 000. Конечно, необходимыми условиями являются наличие хорошей приборной базы (прибор с рабочей частотой для протонов 300 — 500 МГц), правильная стратегия исследования применительно к конкретному объекту и достаточное количество вещества ( — I мкмоль пептида или белка). Большой вклад в изучение пептидов и белков методом ЯМР внесли О. Жар децки К. Коппл и К. Вютрих.

Важнейшим этапом является отнесение сигналов в спектре Н ЯМР Сначала анализируются двумерные спектры, например COSY (корреляционная спектроскопия химических сдвигоа, COSY' - сокращение от английского названия), которые содержат всю информацию о спин-спиновых взаимодействиях (передаваемых через химические связи) между протонами молекулы. Эффективность такого взаимодействия протонов, характеризуемая константой спин-спинового взаимодействия, быстро падает с увеличением числа

113

Строение белков и пептидов

4.

Коппл (Kopple) Кеннет (р. 1930), американский химик-биоорганик, с 1970 г.— профессор Иллинойсского технологического института. Один из ведущие специалистов в области изучения конформации пептидов. Исследовал реакции переноса электронов с целью соз дакия полимерных полупроводников.

Рис Ь5. Спектры комбинационного ра сеяния: а — а-спираль. б — антнпарал-лельная ^-структура, в — пара тлельнаи (1-структура, г Р-изгиб.

114

Белки и пептиды

Вютрих [WUthrlch) Курт (р. 1938). швейцарский биофизик. Окончил Бернский университет, профессор биофизики Швейцарского федерального технологического института в Цюрихе. Основные научные интересы связаны с изучением пространственного строения белков и нуклеиновых кислот с применением методе ЯМР.

Рис. Об. Спин-спиновые взаимодействия в пептидном фра!менте, анализируемые i п< мощью иектр в COSY (u» и NOESY (б».

разделяющих их ковалентных связей и обычно становится ненаблюдаемой уже для четырех связей. Поэтому сигналы протонов аминокислотных остатков можно классифицировать по типам спиновых систем в зависимости от числа атомов водорода при углеродных атомах С", С*\ О и т. д. (рис. 66, а).

Затем анализируются двумерные спектры ядерного эффекта Оверхаузера (сокращенно NOESY), которые содержат всю информацию о диполь-дипольных взаимодействиях между пространственно сближенными протонами молекулы. Величина ядерного эффекта Оверхаузера обратно пропорциональна шестой степени расстояния между ядрами и для пептидов и для небольших белкоа становится пренебрежимо малой при расстояниях ^ 0,4 — 0,5 нм. Основываясь на известной аминокислотной последовательности белка или пептида, спиновые системы протонов (отнесенные к определенным типам аминокислотных остатков) «соединяют» между собой, выявляя диполь-дипольные взаимодействия между протоном NH (i + 1)-го остатка и протонами NH, СН и С'*Н предыдущего i-ro остатка (рис. 66, б). Следуя таким образом адоль полипептидной цепи, получают полное отнесение сигналов в спектре 'Н-ЯМР к определенным остаткам аминокислотной последовательности.

Одновременно с отнесением сигналов в двумерных спектрах 1 Н-ЯМР получают практически всю необходимую информвцию для реконструкции пространственной структуры белка в рвстворе. Так, константы с пин-с пи нового взаимодействия между протонами Н — N С1— НС 'JHNCJH характеризует угол ц), Н — СЧ?— Н (^JHCC^H угол /') (М. Карп л юс, В. Ф. Быстрое) и величины ядерного эффекта Оверхаузера между протонами C',H...HN;±.\ ItUOh) l,CfH...Hl>Ul |d,.N <Х,ГЧ\) |hN,H...HN( + , IdMsOi,, ф,) [позволяют определить торсионные углы ((,. ф„ -/', yj-ro аминокислотного оствтка Анализ ядерного эффекта Оверхвузера между протонами удаленных по аминокислотной последовательно ти остатков дает возможность выявить элементы вторичной структуры белка (а-спирали, fi-структуры, р1 изгибы) Существенное значение имеет обнаружение внутримолекулярных водородных связей, характерных для вторичной структуры белков и пептидов. Для этого изучают скорость обмена атомов водорода группы NH с растворителем (например, дейтерообмен в растворвх JH20) и твким образом получают данные об их доступности внешней среде На заключительном этапе

115

Строение белков и пептидов

Быстров Владимир Федорович

(р. 1935) советский биофизик, член-корреспондент АН СССР (1979)- Окончил Московский университет (1959), с 1964 г. работает в Институте биоорганической химии им- М. М. Шемякина АН СССР- Разрабатывает общие принципы применения спектроскопии ЯМР высокого разрешения для конформа-ционного анализа белков и пептидов в растворах. Лауреат Государственной премии СССР (1985)

Рис. 67. Пространственная структура грамицидина А в мицеллах додеци уль-фата натрия.

116

Белки и пептиды

Рис. 68. Схема укладки полипе и и й цепи нейротоксина II Naja naja oxiana в растворе.

вся совокупность полученных данных (константы спин спинового взаимодействия, ядерный эффект Оверхаузера, доступность протонов NH внешней среде) анализируется с помощью специальных программ на ЭВМ, учитывающих длины валентных связей, валентные углы, ван-дер-ваальсовы радиусы атомов и т. д. Как прааило, при этом удается достаточно точно выяснить конформацию основной полипептидной цепи и наиболее вероятную ориентацию боковых радикалов.

Особую ценность представляет информация, получаемая с помощью спектроскопии ЯМР, о динамических характеристиках пространственной структуры молекулы, ее изменениях в результате изменения среды (рН температура, ионная сила) или взаимодействия с другими молекулами.

Для грамицидина А, представляющего собой линейный пента-декапептид, путем анализа двумерных спектров 1 н-ямр была установлена пространственная структура (рнс. 67) а мицеллах додецил-сульфата натрия. Такие мицеллы хорошо моделируют свойства липидного бислоя мембраны, в которых грамицидин А образует трансмембранный ионный канал. Канал построен из двух правых

N-конец к N-концу («голова к голове»), имеет длину ~ 2,6 нм и внутреннюю полость диаметром около 0,35 нм.

В качестве примера комплексного использования различных методов рассмотрим определение конформации «короткого» белкового нейротоксина II (61 аминокислотный остаток) из яда среднеазиатский кобры

Спектры КД показали, что нейротоксин II сохраняет свою конформацию в широком диапазоне температур, рН, а также при химической модификации ряда аминокислотных остатков. С помощью лазерных спектров комбинационного рассеяния было установлено, что нейротоксин II не имеет а-спиральных участков, а содержание ({-структуры составляет 30%.

Параллельное изучение методом флуорс цеицни природного нейротоксина и его химически модифицированных производных, содержащих да не ильные и спиновые метки, позволило охарактеризовать микроокружение остатков триптофана и введенных меток и определить ряд внутримолекулярных расстоянии.

Исследования методом ЭПР дали информацию о подвижности спиновых меток, селективно введенных в различные участки молекулы. Из анализа спектров ЭПР эастеклованных растворов (—1°6 О производных нейротоксина. содержащих по две спиновые метки, были определены внутримолекулярные расстоянии между не-спаренными электронами этих меток (в частности, таким образом показана сближенность боковых цепей некоторых остатков, удаленных в аминокислотной последовательности ).

Наиболее детальная информация о пространственной структуре нейротоксина II в растворе получена метолом Н ЯМР Бито проведен отнесение игналов к типам остатков и к конкретному положению в аминокислотной последовательности. Изучение скоростей водородного обмена амидных протонов выявило наличие плотной упаковки основной полипептидиой цепи нейротоксина И. Анализ зависимости положения сигналов от рН позволил определить рК практически всех ионогенных группировок и идентифицировать пространственно сближенные с ним аминокислотные остатки {рис. 68, зеленая линии). Значительное число внутримолекулярных расстояний определено с помощью ядерного эффекта Оверкаузера (рнс. 68, синяя линия), а также при исследовании спектров 1 Н-ЯМР производных нейротоксина, содержащих спиновые метки (оценка расстояний на основе анализа у щи рении вызываемых неспаренным электроном спиновой метки (рис. 68, красная линия).

В целом сумма полученных данных позволила установить конформацию нейротоксина II в растворе (рис. 68), которая близка кристаллической структуре родст венного вещества — эрабутоксина Ь из яда морской змеи.

117

Строение белков и пептидов

Бернал (Bernal] Джон Десмонд

(1901—1971), английский физик, кристаллограф, иностранный член АН СССР (1958). Окончил Кембриджский университет (1922), с 1937 г.— профессор Лондонского университете. Ему принадлежат основополагающие труды по рентгеноструктурному анализу вирусов, белков, гормонов Лауре

страница 16
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(29.04.2017)