Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

работы — в области изучения строения белков. Впервые методом рентгено-струкгурного анализа с применением ЭВМ определил пространственное строение молекулы мио глобина и предложил трехмерную модель его структуры (1960). Лауреат Нобелевской премии по химии (1962, .совместно с М. Перутцем).

в кристалле сохраняют и проявляют биологическую активность, что подтверждается прямыми опытами с монокристаллами некоторых ферментов. Так, в ряде случаев удается внедрять непосредственно в кристалл фермента соответствующий субстрат (путем выдерживания кристалла в концентрированном растворе субстрата) и наблюдать расщепление субстрата, протекающее с достаточно высокой скоростью. Сопоставление рентгеноструктурных данных для свободных ферментов и их комплексов с ингибиторами (или псевлосубстратами) дает ценную информацию о конформационных превращениях и механизме функционирования белковых молекул (см. с. 190).

Следует отметить, что все выводы о зависимости между строением и биологической функцией многих белков, сделанные на основании рентгеноструктурных данных, до настоящего времени полностью оправдываются. Таким образом, можно утверждать, что белки, как правило, обладают достаточно устойчивой пространственной структурой, которая в кристалле или в растворе с определенными параметрами среды сохраняет свою компактность и, следовательно, «нативность» в биологическом смысле.

Своеобразная ситуация сложилась с исследованием третичной структуры мембранных белков. В силу гидрофобной природы они

Рис. 52. Схема укладки полипептидной цепи в домене i лактатдегидрогеназы.

нерастворимы в воде, трудно поддаются выделению в индивидуальном состоянии и кристаллизации. Для определения пространственной структуры мембранных белков Р. Хендерсон предложил использовать анализ двумерных кристаллов с помощью электронной микроскопии. Двумерный кристалл — это. по существу, тонкая пленка, представляющая собой липидную мембрану с включенными в нее белками; такая пленка, получаемая с помощью особой техники, характеризуется упорядоченностью входящих в нее молекул. Получитьтрехмерную картину удается в результате анализа образца при различных углах наклона по отношению к направлению пучка электронов.

Точность собираемой таким путем информации зависит прежде всего от качества кристаллов; в большинстве случаев достигается разрешение не выше 1,5—2 нм. Тем не менее метод позволяет делать кыводы о пространственной организации,молекулы, особенно для больших белков, состоящих из нескольких субъединиц. Так, например, в ходе исследования трехмерной структуры цитохром -с-редуктазы фермента системы окислительного фосфорилирования в митохондриях - удалось установить общую форму молекулы ивзаимное расположение ее субъединиц (рис.53). Размер молекулы фермента в перпендикулярном к плоскости мембраны направлении составляет около 15 нм. Центральная часть молекулы, толщиной около 5 нм, погружена в липидный бислой и составляет около 30% всего белка. С одной стороны мембраны участок молекулы фермента (— 50% всего белка) выступает над плоскостью бислоя на 7 нм, с противоположной стороны (~- 20% белка) — на 3 нм. Фермент присутствует в кристалле в виде димеров; наиболее сильный контакт между мономерами наблюдается в центре мембраны.

Аналогичным путем определены также структуры таких мембранных белков, как цитохромоксидаза, К + , Ма + -аденозинтрифос-фатаза, белок межклеточных контактов, рецептор ацетилхолина и др.

Денатурация н ренатурация белков. До настоящего времени в белкоаой химии сохранился термин «неупорядоченная структура» или «неупорядоченный (статистический) клубок». Так называют любые пространственные формы полипептидной цепи, которые не охватываются каноническими конформациями. Принято говорить о переходах а-спираль —»- клубок, р-структура -*¦ клубок и т. п. Такого рода рассмотрение постепенно утрачивает свое значение, ибо неупорядоченная структура, если она входит в состав биологически активного белка, должна описываться в точных терминах (углы if, if, координаты атомов). Однако не канонические формы труднее поддаются характеристике с помощью физико-химических методов, что, по видимому, и обусловило появление не очень точного термина «неупорядоченная структура».

Сложный процесс наблюдается при денатурации белка: специфическая пространственная структура (четвертичная, третичная и вторичная) разрушается, и с точки зрения конформационных характеристик денатурированный белок представляет собой «полный хаос». Денатурация — это такое изменение нативной конформации белковой молекулы, которое происходит при достаточно резком изменении внешних условий и сопровождается заметным изменением физико-химических свойств белка и полной потерей биологической активности.

В большинстве случаев белки денатурируют при 50 — 60 °С, а термостабильные белки — при температурах около 100 °С. Температура, при которой 50% нативного белка подвергается денатурации, называется температурой перехода. Наглядным примером такого рода тепловой денатурации является свертывание белка при варке яиц.

103

Строение белков и пептидов

Анфинсен lAnflnsenJ Кристиан Бемер

[р. 1916), американский химик и биохимик. Окончил Пенсильванский университет (1939), с 1963 г.— руководитель лаборатории биохимии в Национальном институте здоровья в Бе тес де (близ Вашингтона). Основные работы посвящены изучению структуры и функции, а также синтезу белков. Ему принадлежат основополагающие труды по расшифровке первичной структуры рибонуклеазы, механизму ее денатурации и ренагурвции. Лауреат Нобелевской премии по химии (1972, совместно с С. Муром, У. Стейном).

104 В некоторых случаях денатурацию вызывает весьма неэначи-

тельное изменение рН среды- Одни белки стабильны при кислых

Белки и пептиды значениях рН (например, пепсин), другие — при щелочных (щелоч-

ные протеиназы), третьи — при нейтральных. Часто для денатурации белков используют 8М раствор мочевины или 6М раствор гидрохлорида гуанидина.

Рис. 53. Пространственная модель ди-мера цитохром- с-редуктаэы в мембране.

Нередко денатурация белка проводится с помощью детергентов. Существует четыре класса детергентов. Наиболее часто используемыми анионными детергентами являются додецилсульфат натрия, холат и дезоксихолат натрия. Анионные детергенты действуют при значениях рН ниже изоэлектрической точки белка. Катионные детергенты в основном представлены алкильными производными триметилвммонийбромидов или хлоридов (например, тетрадецил-, тридецил- и додециламмонийбромиды), которые вызывают осаждение белка при щелочных значениях рЙ. В настоящее время часто используются увит тер-ионные детергенты (цвиттергенты), позволяющие работать в широких диапазонах рН. Сравнительно недааио вошел в практику 3 (3 холамидопропил)диметиламмоний-3-про-пансульфонат (ЧАПС — фирменное название по первым буквам английского названия детергента) — цвиттер-ионное производное холевой кислоты. Наконец, широко применяются неионные детергенты, такие, как тритон X 100, твин 20 твин-60, твин-80, эмуль-фоген, дигнтонин, алкиловые эфиры сахарозы (например, р-октил-гликозид).

Такие реагенты, как R-меркаптоэтанол и дитиотреитол, восстанавливающие дисульфидные связи, обычно облегчают денатурацию белков. В ряде случаев денатурации могут способствовать хелатирующие агенты (например, этилендиаминтетрауксусная кислота), которые связывают двухвалентные катионы (Са, Mg и др.),

играющие роль кофакторов ферментов. Напротив, добавление кофакторов или субстратов делает ферменты более устойчивыми к денатурации. В случае мембранных белков стабилизирующий эффект оказывает добавление липидов.

Важной является проблема обратимости денатурации, т. е. возможность вновь получить белок с исходной пространственной структурой и биологическими свойствами. Такой процесс называется ренатурацией. Впервые полную ренатурацию белка удалось осуществить на примере рибонуклеазы (К. Анфинсен, 1961).

Если полностью «развернуть» молекулу рибонуклеазы путем восстановления четырех ее дисульфидных мостиков при действии меркаптоэтанола в 8М растворе мочевины, а затем провести окисление в контролируемых условиях, то молекула вновь приобретает нативную конформацию и полностью восстанавливает ферментативную активность (рис. 54).

Эти опыты показывают, что программа «самосборки» белка закодирована в его первичной структуре. По всей вероятности, важное значение при ре на ту рации белка имеет образование «ядер», т. е. небольших участков упорядоченной вторичной структуры (стадия нуклеации). За этим сравнительно медленным процессом следует быстрое сворачивание цепи в нативную структуру. На первых этапах ренатурации белков, в поддержании нативной конформации которых участвуют дисульфидные мостики, образуются промежуточные производные с «правильными» и «неправильными» дисуль фидными связями. В ряде случаев удавалось останавливать процесс ренатурации на определенных стадиях н выделять такие частично свернутые формы. Поскольку в целом сборка белка является достаточно быстрым процессом, можно сделать вывод о том, что природа не перебирает все возможные комбинации в очередности замыкания дисульфидных мостиков (при 4 S—S связях их 105, а при 5— уже 945), а сворачивание полипептидной цепи идет по ограниченному числу направлений и приводит к конформации, характеризующейся минимальной свободной энергией.

Изучение процессов денатурации и ренатурации, которое проводится с помощью разнообразных физико-химических методов (седиментация, оптические методы, метод ядерного магнитного резонанса, электрофорез, хроматография и др.), позволяет лучше

105

Строение белков и пептидов

Рис. 54. Денатурация рибонуклеазы А.

и ренатураинн

С

Нативнак моленула

Восстановленная д ен в турир о ван н а в молекула

106 понять конформационные особенности белков, устойчивость их

- пространственной структуры и природу взаимодействий, важных

Белки и пептиды для стабилизации нативной конформацни и проявления биологи-

ческой активности.

Пространственная структура пептидов

Конформационные состояния пептидов определяются теми же силами и взаимодействиями, что и пространственная структура белков. Однако меньшие размеры молекул снижают число анутри-молекулярных контактовв пептиде, что приводит к увеличению роли среды в стабилизации конформацни пептида, уменьшению энергетической дифференциации форм и в целом к увеличению конформационной подвижности пептидов по сравнению с белками, фрагментами которых в ряде случаев они и являются. Этим обстоятельством можно объяснить тот факт, что для большинства природных и синтетических линейных пептидов исследования в растворах не обнаружили четко фиксированных структур. Как эксперимен тальные, так и расчетные данные свидетельствуют об участии в равновесии сложного ансамбля конформеров, из которых с большей или меньшей степенью надежности выявлялись характеристики отдельных форм. При этом оставался открытым вопрос о том, какая из выявленных форм отвечает «биологически активной»

структуре, т. е. структуре, ответственной за выполнение биологической функции.

Существенно иная ситуация сложилась при исследовании циклических пептидов. К ним относятся ряд физиологически активных пептидов, содержащих дисульфидные связи (гормоны, токсины), многие пептидные антибиотики, а также большое число модельных синтетических пептидов. На многочисленных примерах показано, что циклическая структура, существенно ограничивающая конфор-мационную подвижность пептида, способствует формированию небольшого числа специфических конформации.

Циклопептиды с относительно малым размером цикла (6—12 атомов) имеют весьма ограниченную подвижность циклического остова и часто содержат в своем составе i^uc-амидные связи (К. Бла-ха, 1967). В частности, широко распространенные циклодипептиды (например, 2,5-дикетопипераэины) (рис. 55) имеют исключительно i^ifc-амидные связи (вторичные или третичные), аналогичным свойством обладают и циклотр и пептиды (хотя их исследовано гораздо меньше), в циклических тетрапептидах обычно встречаются как уме так и гранс-амидные связи. Несколько примеров приводится на рисунках 56 и 57. В циклах больших размеров цис амидные связи встречаются шачительно реже, притом только для третичных амидов, образованных с участием пролина, N-метиламинокислот или других N-замешенных аминокислот.

Начиная с циклических пентапептидов часто встречающимся элементом а циклических пептидах становятся Ji-изгибы (водородные связи типа 4 I); кроме того, встречаются (хотя и реже) так называемые -у-изгибы (водородные связи типа 3-*-1) (рис. 58).

107

Строение белков и пептидов

Рис. 56. Конформация цикло(-Рго), в растворе и в кристалле.

Рис. 57. Пространственная структура цикло( Рле Pro- Ala -Pro—).

Pro

Рис. 58. Возможные типы внутримолекулярных водородных связей в циклических лентапептидах.

108 Обобщая теоретические представления о конформацни средник ----циклов, И. Дале в 1°63 г. пришел к выводу, что минимальным раз-Белки и пептиды мером пептидного цикла, в котором становится возможной реализация свободной от напряжения алмазоподобной структуры, является гексапептидный 18 членный цикл. Действительно, циклогек-са пептиды образуются с высокими выходами из различных исходных продуктов; описаны сотни представителей этой группы, как синтетических, так и природных.

В циклопептидах с шестью (рис. 59) и большим числом остатков возможно образование коиформации складчатого листа. Наиболее яркий пример — антибиотик грамицидин S (см. с. 285). В процессе синтеза грамицидина S (Р. Швицер, 1957) была впервые обнаружена так называемая реакция удвоения, представляющая собой частный случай реакции циклоолигомеризации:

h;n| [сох—-h;n (| Ijcox—h;n(| l^cox—

1 I I

Рис. 54. Конформация складчатого ли-стацикло!- (Val Val—С1уЫ вводе.

Получение из линейного пентапептнда грамицидина S, т. е. цикл о- 109

пептида с удвоенной длиной цепи, протекает особенно легко, что, - -

по-видимому, объясняется конформационными факторами — обра- Строение белков и пептидов

зованием антипараллельных р"-структурных ассоциатов (рис. 60, а, б) или Р-шпилек (рис. 60, в) на стадии, предшествующей циклизации.

Аналогичные процессы наблюдаются и для линейных трипеп-тидов, легко циклизующихся в циклогексапептиды

Конформации циклопептидов, содержащих 15 — 20 и более атомов в цикле, хотя и ограниченные в своей подаижнс<сти, тем не менее имеют достаточно большое число степеней свободы, и обычно в равновесии находятся несколько форм близкой энергии. Наиболее устойчивы в конформационном отношении циклопептиды, имеющие добавочный ковалентный мостик, т. е. макробициклнческую струк

I I ! ) I

I » -I I И I '

OR Н

г

.с гзн-сох

i И

О II

R О Н R

9Н и i i и i i

О H R О

CO

ii

о

NH I

CO

ГЦ'

H OR

(61

H R H R О

t

I

CH

о

II

о

CH''"

I

NH

R '^с^Чсн^^И^сох H^^CH' II I I I

OR H R

CO CH

Nl/ ^R

I

Рис. 60. Конформации линейных пента-пептидов, способствующие реакции удвоения

110

Белки и пептиды

рис. 61. Конформация метиламида ацетил D пролина в CCIi и

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(28.04.2017)