Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

и ограниченный триптический гидролиз (только по остаткам аргинина) малеилированного и карбоксиметнлированнаго образца, что позволило в конечном ито! е выделить и идентифицировать все пептиды, составляющие полипептидную цепь белка. Нахождение перекрывающихся пептидов с целью реконструкции полипептидиой цепи ж партатаминотрансферазы потребовало применения нескольких ферментативных и химических методов расщепления белковой молекулы.

Недостаточна и информативность каждого hi этих методов в отдельности была связана с трудностью выделения всех необходимых пептидов и с наличием в полипептидной цепи белка однотипных повторяющихся последовательностей.

Аминокислотная последовательность ас парта таминотрансферазы изображена на рисунке 29. Этот фермент содержит две одинаковые полипептндные цепи, построенные из 412 аминокислотных остатков каждая. Молекулярная масса одной полипептидиой цепи равна 46 344, а всего холофермента (с учетом двух молей пиридоксальфосфата) - УЗ 147.

Широкое исмчльювание секвенатора можно проиллюстрировать на примере опубликованной в 1973 г. К. Уолшем, Г. Нейрвтом и сотр. работы по определению первичной структуры свиного трипсина. Общая стратегия исследования представлена на рисунке 30.

Прямым исследованием свиного р-трипсина с помощью секвенатора удалось определить последовательность первых 39 аминокислотных остатков (аминокислоты с 7 по 45, нумерация аминокислот, как у бычьет трипсиногена). Образец р-трипснна содержал примесь а-трипсина, образующегося в результате разрыва связи Lys— Ser (131 132) при автол и ie. Анализ С-концевого фрагмента (Я.-С1 на секвенато-ре позволил установить последовательность аминокислотных остатков с 132 по 171

Содержащий два остатка триптофана N концевой фрагмент а-трипсина (ct-N) был обработан В N PS-скатолом. Из образовавшейся смеси пептидов выделялся фрагмент (41 127), при исследовании которого была установлена последовательность аминокислот с 41 по 75 остаток. Далее молекула fi-трипсина расщеплялась бромцианом по остаткам метионина и гидроксиламином по связи Asm — Gly и шдролизовалась трипсином по остаткам аргинина после предварительного блокирования *-аминогруппы остатков лизина с помощью янтарного ангидрида. Два

77

Строение белков и пептидов

Рис. 29. Аминокислотная последовательность цитоплазматической аспартат амннотранефс-разы т сердечной мышцы

Ни]

2548085982254858

78

Белки и пептиды

последних метода расщепления использовались татке при изучении С концево. фра.мента «-трипсина (а — С) и N-концевого бромцианового фрагмента (СВ N). Во всех случаях аминокислотная последовательность выделенных пептидов исследовалась с помощью секвенвтора. Таким образом, была установлена практически полная первичная структура (кроме остатков 228 и 22У) свиного трипсина.

В изучении первичной структуры белков достигнут значительный прогресс. Ежегодно устанавливается полная структура около 100 новых белков. Определены аминокислотные последовательности таких сложных ферментов, как гликогенфосфорилаза и [i-галактозидаза, содержащих соответственно 841 и 1021 аминокислотных остатков в одной полипептидной цепи. Наряду с этим

Уолш (Walihl Кеннет (р. 1931), американский кимим-биоорганик. Окончил Торонтский университет (1959) в настоящее время работает в Университете шт. Вашингтон (Сиэтл). Основные работы — по выяснению взаимосвязи между структурой и функцией белков. Разработал эффективные подходы к выяснению первичной структуры белков. Определил аминокислотные последовательности ряда п ротео л и т и чески х ферментов, факторов свертывания крови, фосфодиэстервэ и других белков.

1. Автолиз по Lys 131

УЛ ^~~т

Расщепление

BNPS-скатолом по Тгр 40,127

2. Расщепление BrCN по Mel 92,166

Гидролиз

трипсином по Arg 51 55

432 171 [ Расщепление | NH2OHno Asn-Gly 190-191

3. Расщепление NHpH по Asn-Gly ВЗ-84 и 190-191

4. Гидролиз трипсином no Arg 51,55,105,113

I ^Ri

5- Реконструкция полипептидной цепи

Рис. 30. Схема установления первичной структуры трипсина. Окрашены участки полипептидной цепи, структура которых определена с помощью секвенатора.

в структурной химии белка в настоящее время имеются определенные проблемы. Наибольшие сложности возникают у исследователей, имеющих дело с мембранными белками, белками, выделяемыми в ничтожно малых количествах, и с белками большой молеку лярной массы (М > 100 000).

При изучении мембранных белков необходимо принимать во внимание присущие им необычные свойства. Высокое сродство этих белков к липидам и гидрофобность приводят к практически полной их нерастворимости в водных средах. Пептидные фрагменты, полученные при гидролизе мембранных белкоа, также плохо растворимы и обладают повышенной склонностью к агрегации Эти и некоторые другие сложности встретились при исследовании структуры бактериородопсина — основного белка пурпурной мембраны гало фильной бактерии Halobacterium haloblum

Уменьшение количеств белков и пептидов,» необходимых для анализа их структуры, является одной из центральных проблем, стоящих перед исследователями. С целью ее решения ведется поиск новых методов изучения структуры, в частности более чувствительных способов идентификации производных аминокислот (см. с. 61). Один из перспективных подходов заключается в широком использовании радиоактивных методов анализа. В ряде лабораторий при деградации пептидов в секвенаторе применяется радиоактивный 35S- или |4С-ФИТЦ. Можно вводить радиоактивную метку непосредственно в анализируемый белок. Для многих белков это достигается добавлением радиоактивно меченных аминокислот непосредственно в питательную среду, на которой выращивается культура, являющаяся источником исследуемого белка. Таким же путем оказывается возможным радиоактивно метить белок избирательно по определенным аминокислотным остаткам. Если белок, радиоактивно меченный, например, по остаткам лейцина, анализировать с помощью секвенатора, то простое измерение радиоактивности экстрактов, содержащих анилинотиазо иноны позволяет безошибочно определить, в каких положениях полипептидной цепи в N-концевой области белка расположены остатки лейцина (рис. 31). Аналогичным образом можно определить положение и других аминокислотных остатков. Такой прием используется для анализа N-концевой последовательности предшественников белков, доступных лишь в ничтожно малых количествах. Для исследования полной структуры он, однако, не применяется из-за дороговизны и трудоемкости.

Особые задачи возникают при исследовании первичной структуры сверхкрупных белков (молекулярная масса более 100 000), поскольку с ростом молекулярной массы все сложности увеличиваются в геометрической прогрессии. Одни из возможных подходов в этом случае заключается в использовании ограниченного протеолиза для расщепления исходного белка на небольшое число фрагментов средней молекулярной массы (20 000 — 40 000) и в последующем исследовании фрагментов как отдельных белков.

Этот прием был использован при определении структуры фактора элонгации биосинтеза белка EF—С (Ю. Б. Алахов и др., 1976). Инкубирование EF—С (М 81 000) в нативном состоянии с трипсином приводит к образованию четырех сравнительно устойчивых к дальнейшему действию трипсина фрагментов T4,Ti,Ti, и Т? (М 41 000, 27 000, 8000 и 3000 соответственно). Фрагменты были выделены в гомогенном виде, установлено их строение и расположение а полипептидной цепи белка (рис. 32).

Развитие методов анализа нуклеотидной последовательности ДНК сделало возможным на основе генетического кода выводить соответствующие аминокислотные последовательности исходя из установленных нуклеотидных. При реализации такого подхода

79

Строение белков и пептидов

Питательная среда с ,aC-Leu

Анализ

на секвенаторе

Измерение радиоактивности ФТГ на стадиях деградации

|Пп|Пп||Пп

1 2 3 4 5 6 7 8 91011 .-•u-X-X-Leu-X-X-Lcu-Ltu-X-X-Lei

Рис. 31. Анализ аминокислотной последовательности бетка, радиоактивно меченного по отдельным аминокислотам.

во

Белки и пептиды

Рис. 32. Ограниченный гидролиз трипсином фактора элонгации EF—G. Кинетика образования трипти еских фрагментов (вверху) и их расположение в полипептидной цепи белка (внизу).

следует, однако, иметь в виду целый ряд ограничений и возможные источники ошибок. Во-первых, выведенная из нуклеотиднои аминокислотная последовательность может не соответствовать реальной вследствие процессинга, который часто происходит как на уровне информационной РНК, так и при превращении белка-предшественника в конечный белок. Во-вторых, лишь одна ошибка в определении последовательности ДНК (пропуск или вставка) приводит к выведению совершенно неправильной аминокислотной последовательности белка.

Таким образом, установление первичной структуры ДНК не всегда может заменить непосредственное исследование аминокислотной последовательности кодируемого ею белка. В то же время параллельное изучение первичных структур белка и ДНК чрезвычайно эффективно

Установление нуклеотиднои последовательности дает возможность расположить изученные пептидные фрагменты в непрерывную полипептидную цепь, позволяя решать, таким образом, наиболее сложную задачу структурного анализа белка. С другой стороны.

МОЛ.%

20 304060 80 МИН 0

т т

т

I

т

¦

EF-G

Т,

данные по аминокислотной последовательности пептидов упрощают и уточняют анализ нуклеотидной последовательности. Параллельное изучение первичных структур белка н ДНК было использовано, в частности, при определении аминокислотной последовательности Р- и р'-субъединиц ДНК-зависнмой РНК-полимеразы E.coli, полипептидные цепи которых состоят из 1342 и 1407 аминокислотных остатков соответственно (В. М. Липкин, Е. Д. Свердлов и др., 1980).

В последние годы анализ первичной структуры белков на основе исследования нуклеотидной последовательности соответствующих генов принимает все большие масштабы. Первоначально такие исследования касались белков прокариотических организмов, в основном Е. coli, генетика которых хорошо изучена, и получение структурных генов не представляло большого труда. По мере развития методов генной инженерии появилась возможность выделять также структурные гены белков эукариот.

Во многих ведущих лабораториях мира созданы так называемые банки или библиотеки генов многих высших животных и человека. В этих банках гены разнообразных белков хранятся в составе специальных векторов - - плазмид или фагов. Для выделения соответствующего гена из банка используются гибридиэационные зонды — небольшие нуклеотидные фрагменты, синтезированные на основе установленной аминокислотной последовательности пептидов исследуемого белка. Из-за «вырожденности» i-енетического кода могут использоваться не любые последова тельности для этой цели. Подходящими являются пептиды, содержащие в своем составе аминокислоты, представленные одним или двумя кодонами, поскольку в этом случае минимально число различных вариантов олиго нуклеотидов способных кодировать данный пептид. Оптимальными являются пептиды, содержащие остатки метионина и триптофана, кодируемые уника ьнымн кодонами. Поэтому особое значение приобретают исследования по выделению и изучению таких пептидов. Имеются и другие методические подходы для выделения структурных генов белков, связанные, в частности, с их способностью в определенных условиях экспресснровиться. Синтезируемый в результате экспрессии белок может быть идентифицирован, например сим шью нммунохнмических методов (см с 4Ду).

81

Строение белков и пептидов

Липкин Валерий Михайлович (р. 1942), советский химик-биоорганнк Окончил Московский химико-технологический институт им. Д. И. Менделеева (1964), с 1965 г. работает в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР. Основные работы — в области изучения химической структуры белков. Лауреат Государственной премии СССР (19В2).

Возможности современных методов генной инженерии открыли широкие перспективы для изучения белковых систем, которые еще вчера казались недоступными для исследователей вследствие их чрезвычайно низкого содержания. В частности, совсем недавно Ш. Нуме удалось определить структуры ацетил холи нового рецептора и основного компонента натриевого канала нз электрического органа рыбы Elecirophorus electricus.

Сегодня известны первичные структуры более 2000 белков, причем все возрастающая информация поступает из анализа нуклеотидной последовательности генов. Для тех, кто старается более глубоко понять язык аминокисютных последовательностей, доступен уже огромный материал — обширный текст, который в целом представляет собой существенные фрагменты «книги жизни». Что может дать более глубокий его анализ? Бесспорно, он совершенно необходим в изучении связи между строением н функцией отдельных представителей пептидно-белковой природы. Но, может быть, он приведет нас к открытию более общего «белкового кода», позволит нам в будущем в той нли иной мере предсказывать свойства белков по их первичной структуре. Это уже можно делать достаточно успешно в отношении пространственной структуры. А биологическая роль? Вряд ли природа придумала аминокислотный алфавит из 20 букв случайно. Есть над чем подумать, и все возрастающий поток новых данных по аминокислотным последовательностям отнюдь не делает каждый новый шаг в этом направлении более скучным,— напротив, он воодушевляет нас, рождает новые пути и концепции и вновь и вновь обращает нас к вопросу о тайне химической азбуки живого.

Нуме (Ниша) Шосану (р. 1929), японский биохимик- Окончил университет Киото (1952); работал в США и ФРГ (1956—1967), с 1966 г—профессор университета Киото. Широко известен работами по установлению первичной структуры мембранных белков с помощью методов генной инженерии (ацетил холи новый рецептор. На4 -канал возбудимых мембран, трансду-цин и др.)

Пространственное строение белков и пептидов

Каждый белок или пептид специфическим образом свернут в пространстве, и эта конформация определяет его физико-химические и биологические свойства. Пространственная структура белка (пептида) в целом кодируется его первичной структурой. Эта взаимосвязь создает предпосылки для теоретических расчетов и предсказаний вторичной структуры белков на основе их аминокислотной последовательности. Пространственная структура достаточно подвижна, т. е. способна изменяться под воздействием внешних условий илн различных агентов, и в этом смысле правильнее говорить о предпочтительной конформацни белка или пептида, об одной из многих, энергетически наиболее выгодной пространственной структуре. Среда, даже наиболее естественная, не может не вызывать ответной реакции белковой молекулы, и особенно тех ее группировок, которые расположены на поверхности глобулы и участвуют в многочисленных взаимодействиях. В жнвой клетке белок находится в постоянно меняющемся окружении н вынужден как-то перестраиваться, когда ему приходится вступать в контакт с соседними белквми, рецепторами нли такими постоянными партнерами, как нуклеиновые кислоты, лнпиды, полисвхариды ионы металлов и другие низкомолекулярные соединения. Поэтому естественно стремление исследователя получить более полную информацию о динам

страница 12
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.09.2017)