Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

муществ по сравнению с ФТГ. ' ~\_/ \_/ —

Наибольшее распространение в практике лабораторных исследо- 3 ваний получил 4-ГЧ^-диметиламиноазобензол-4'-изотиоцианат

(ДАБИТЦ) ДА бит ц

Образующиеся при деградации пептида с ДАБИТЦ ярко-розовые

4-N, ГЧ-диметиламиноаэобензол-4'-тиогидантоины (ДАБТГ) имеют

коэффициент экстиикции (е43В = 34 ООО) примерно в два раза более

высокий, чем у ФТГ. Чувствительность идентификации ДАБТГ при

тонкослойной хроматографии на полиамиде составляет 0,01 — 0,05

нмоль (рис- 18).

Чтобы избежать необходимости использования высоких температур (75'С) для количественного связывания ДАБИТЦ с N-концевой аминогруппой, применяется двойное карбамсилирование (сначала с ДАБИТЦ, а затем с ФИТЦ) при обычной температуре (45 "С). Метод дает хорошие результаты особенно при анализе труднорастворимых гидрофобных пептидов. К его недостаткам следует отнести затруднения с идентификацией неустойчивых ДАБТГ серина, треонина и лизина.

Arg His

Asn Gin * * Glv Ser#Thr* $Ala

Glu j Pro Asp* #Cys Ser m^'b

V*t,pb e/"||iru

^ Thr _

Lys

ДАБИТЦ

Рис. 18. Разделение ДАБТГ-аминокис-лот двумерной тонкослойной хромато графией на полиамиде.

62

Белки и пептиды

CHj СНэ I I НО—СН сн—он

I I

СНз СН2 I

CHj

I

CH, I

CH, CH„

HO—CH

I

CH3

CH—OH

I

Автоматическое определение вминокислотной последовательности. Крупным достижением в области структурных исследований белков явилось создание в 1967 г. П. Эдмаиом и Дж. Бэггом секве натора — прибора, который с высокой эффективностью осуществляет последовательное автоматическое отщепление N концевых аминокислотных остатков по методу Эдманв. В секвенаторе все реакции проводятся в цилиндрическом стеклянном стаканчике (рис. 19), вращающемся с постоянной скоростью в атмосфере инертного газа. Исследуемый образецбелка наносится в виде тонкой пленки на стенки стаканчика, а реактивы и растворители по шлангу подаются на его дно. За счет центробежной силы они поднимаются по стенкам, соприкасаются с пленкой белка, затем собираются в специальной канавке в верхней части стаканчика н удаляются по отводному шлангу. Большая поверхность соприкосновения между двумя фазами способствует легкому проникновению реагентов сквозь пленку белка, быстрому протеканию реакций и беспрепятственной экстракции продуктов реакции.

В секвенаторе исключен контакт анализируемого образца белка с кислородом воздуха и стандартизованы условия проведения всех стадий реакции. Наряду с тщательной очисткой используемых реагентов и растворителей, это позволяет проводить автоматическое отщепление аминокислотных остатков с выходом 95% и выше. Для предотвращения испарения реагентов в большой объем реакционного стаканчика в качестве основания в реакции присоединения применяют квадрол— (N,N,N/,N/-TeTpaKHc-2-rHuipOKCHnporiHn)-этилендиамин, а в реакции отщепления — гептафтормасляную кислоту, обладающие пониженной летучестью,

В секвенаторе проводятся только первые две стадии реакции Эдмана — присоединение и отщепление. Образовавшиеся в результате анилинотиазолиноиы экстрагируются и собираются в коллекторе фракций. Их превращение в ФТГ осуществляется вручную или с помощью автоматической приставки — конвертере.

Наилучшими объектами для жидкофазного секвенатора являются белки и пептиды, содержащие в своем составе от 60 до 200 аминокислотных остатков. Для них обычно удается определять последовательность 30 — 50 остатков. При исследовании более крупных белков в процессе деградации наблюдается значительный гидролиз

Рис. 19. Схема реакционной камеры жидкостного секвенатора-

лабильных пептидных связей внутри полипептидных цепей. С другой стороны, короткие пептиды, особенно пептиды, с о держа иди е в своем составе гидрофобные аминокислотные остатки, интенсивно вымываются из стаканчика секвенатора. Для предотвращения такого рода потерь пептидов разработан ряд методических приемов. Один из них предусматривает добавление в реакционную камеру специальных носителей, препятствующих механическому удалению пептида. В качестве носителей используются белки, не содержащие свободной а-аминогруппы (например, цитохром с), или синтетические полимеры: полиорнитин и полибрен.

Вг~ Вг

СН3 СНя

J J _N—(CHJe—N—(CHah-

I I

СНЭ CH3

Полибрен

Растворимость пептида в органических растворителях резко уменьшается при увеличении его гидрофильности. Для повышения гидрофильности можно использовать так называемые реагенты Брауницера, являющиеся высокополярными аналогами фенилизо тиоцианата.

63

Строение белков и пептидов

Брауницер [Braunltz г] Герард

(р. 1921) немецкий химик-биоорганик. Окончил Технический университет в Граце (1947), с 1972 г.— директор Института биохимии Общества М. Планка в Map инсриде (ФРГ). Установил первичную структуру белка вируса табачной мозаики (1956) и большого числа гемоглобинов.

SOsH

Реагент Брауницера I

503Н

Реагент Брауницера I

Если на первой стадии деградации по методу Эдмана вместо ФИТЦ добавить реагент Брауницера, то за счет модификации аминогрупп значительно повысится гидрофильность лизине о держащих пептидов, в результате чего они могут успешно анализироваться с помощью секвенатора.

Другой вариант автоматического определения аминокислотной последовательности коротких пептидов, основанный на ковалент ном присоединении их к нерастворимому носителю, предложен Р. Л а рее ном Реакционным сосудом в твердофазном секвенаторе служит хроматографическая колонка, с носителем которой ковалентно связан исследуемый пептид. Через колонку последовательно пропускаются необходимые реагенты и растворители. Присоединение пептида к носителю является определяющей стадией в процессе. Для этой цели широко применяются матрицы на основе

Ларсен ILaurs п| Ричард Алпан

[р. 1938), американский химик и биохимик. Получил образование в Калифорнийском университете в Беркли [1961) и Иллиноиссколя университете в Урбане (1964). работал в Бостонском университете (1966). Впервые предложил метод твердофазной деградации пептидов.

64 полистирола и пористого стекла. В качестве функциональной груп-

- пы, реагирующей с пептидом, обычно используется алифатическая

Белки и пептиды (ароматическая) аминогруппа, связанная с носителем «ножкой»

различной длины.

Легко могут быть иммобилизованы бромциановые пептиды, содержащие в качестве С концевого остатка реакционноспособный л а кто н гомосерина; для полного превращения остатка гомосерина в лактон они предварительно обрабатываются трифторуксусиой кислотой.

сн.— сн.

-NH—СН—CO— NH—СН О + NH2— Р

NH3

Амимополистирол

R СН2—СН—ОН I I -NH—СН—СО—NH—СН—СО—NH— Р

Конденсация лактона гомосерина с аминогруппами носителя обычно проходит с выходом 60 — 100% и не сопровождается по-бочными реакциями. Аналогичным образом для ковалеитного присоединения пептидов используется лактон, образующийся при расщеплении пептидных связей по остаткам триптофана с помощью N бромсукцинимида или BNPS-скатола (см. с. 50).

Л и зинсо держащие пептиды присоединяются к носителю по аминогруппам путем конденсации с п фенилеидиизотиоцианатом При этом связанной с носителем оказывается также и а амино группа N концевого остатка пептида. Однако после первого цикла деградации освобождается а-аминогруппа второго аминокислотного остатка, и процесс может быть продолжен обычным образом.

Пористое Пористое стекло стекло

/1\

ООО

\|/

(CHJ3

I

NH

I 3-А.

[СН2)2

/|\

ООО

\|/

|СН2)3

I

NHa

иноп роли л-с тепло

NH

NH—С | \

(СН!)з KHs

I

- NH — СН — СО----

1

NHj

N (2 Аминоэти } З-.ялинопропил-стекло

NH3—NHj

NH2 I

(CHj)3

I

-NH —CH —CO---

Метод применим также для пептидов, содержащих остатки 65

аминоэтилцистеина и аргинина. Последние предварительно превра-----—

щаются в остатки орнитина с помощью гидразинолиза. Строение белков и пептидов

Условия гидразинолиза являются достаточно жесткими (80 °С, 64%-ный гидразин, 10 мин), что приводит к частичному расщеплению пептидных связей, а общий выход реакции присоединения не превышает 30 — 55%.

Пептиды, содержащие цистеин, могут быть ковалентно присоединены к специальному носителю с помощью реакции тиол-дисульфидного обмена (см. выше).

Наиболее общий вариант иммобилизации пептида — присоединение по С-концевой карбоксильной группе. В качестве конденсирующих агентов используются водорастворимые карбодиимиды (например, N этил N диметиламииопропилкарбодиимид) Как правило, а-аминогруппа пептида предварительно защищается с помощью легко удаляемой трет-бутоксикарбонильной группы или ФТК-груп-пы, образующейся при реакции с ФИТЦ. В отличие от перечисленных выше методов, выходы при конденсации с помощью кар-бодиимида непредсказуемы и колеблются в диапазоне 0 — 90%. Легче других присоединяются к носителю короткие аргининсодер-жащие пептиды.

Белки и пептиды

^^^^

¦ft

Худ |HocdI Лером Е (р 1938) амери камский биохимик. Образование получил в Калифорнийском технологическом институте, в настоящее время — директор Ракового центра там же. Научные интересы связаны с изучением антигенов главного комплекса гисто-совместимости. Создал ряд автоматических методов анализа первичной структуры белков.

H2N----СО—NH—СН—СООН

Вое взнд

Вое — НН ¦

— СО—NH—СН—СООН

R—N=C N—R

Вое — мн----с'

HgN----CO-NH-CH-C

Твердофазный секвенатор позволяет получать наилучшие результаты при анализе пептидов, содержащих от 5 до 40 аминокислотных остатков. Иногда он применяется и для изучения структуры более крупных пептидов и белков, особенно гидрофобных, легко вымываемых из реакторов жидкофазного прибора. С помощью этого метода удается определять последовательность 20 — 25 аминокислотных остатков.

В 1981 г. Л. Худ и М. Хаикепиллер сконструировали новую модель секвенатора — газофазный секвенатор, предназначенный для анализа микроколичеств белков и пептидов. В приборе (рис. 20) исследуемый образец наносится на небольшой (диаметр 10 мм) диск из пористого стеклянного волокна, пропитанный полибреном. После высушивания диск зажимается между двумя стеклянными цилиндрами, образующими миниатюрную реакционную камеру (внутренний объем 0 05 мл) (рис. 21). Через капилляр в центре верхнего цилиндра (диаметр 0,5 мм) в реакционную камеру подаются необходимые реагенты (летучие — в газообразном состоянии), которые, проходя через поры диска, взаимодействуют с адсорбированным на нем белком или пептидом и далее выводятся через капилляр в нижнем цилиндре.

Нековал нтная иммобилизация образца на пористой пластинке, уменьшение объема реакционной камеры и соответственно расхода реагентов и растворителей для промывок позволили сократить до

минимума потери материала в процессе деградации на газофазном секвенаторе и тем самым снизить количество анализируемого пептида или белка до уровня 100 — 500 пмоль.

67

Строение белков и пептидов

Рис. 20. Газофазный секвенатор АП-ПЗ (НТО АН СССР, г. Ленинград).

Ферментативные методы. Для определения структуры пептидов и белков можно применять ферменты, катализирующие отщепление N- и С концевых аминокислотных остатков полипептидной цепи (аминопептидазы и карбоксипептидазы).

Гидролиз пептидов с помощью карбоксипептидаз является основным способом определения С-концевого остатка и С-концевой аминокислотной последовательности. При исследовании структуры пептидов и белков используются карбоксипептидазы А, В, С и Y. Карбоксипептидазы A (CPA) и В (СРВ) выделяют из поджелудочной железы крупного рогатого скота, карбоксипептидазу С (СРС) — из кожуры и листьев цитрусовых, карбоксипептидазу Y (CPY) — из пекарских дрожжей.

Общим требованием к субстрату для всех карбоксипептидаз является наличие а-карбоксильной группы у С-концевой аминокислоты. Природа боковой цепи у отщепляемого аминокислотного остатка — основной фактор, определяющий скорость гидролиза пептидной связи. На скорость отщепления С-концевой аминокислоты в большой степени влияет также природа соседнего с ней остатка. Расположенные в соседнем положении аминокислотные остатки с ароматической или алифатической боковой цепью, а также остатки дикарбоновых аминокислот значительно ускоряют отщепление С-концевой аминокислоты. Напротив, если в соседнем положении находятся глицин и пролин, скорость гидролиза снижается.

Подача реактивов и растворителей

Стеклянный цилиндр

Рис. 21. Схема реакционной камеры газофазного секвенатора.

68 Таблица з

Скорости отщеплении аминокислот карбоксипептидазамн А и С

Тип отщепления CPA CPC

Быстрое отщепление Туг, Phe, Leu, Trp, 11с, Met, Thr.Gln, His, Ala, Val, HSer Phc, Туг, Тф. Leu, lie, Val, His

Медленное отщепление Asn, Scr, Lys, MelSOf Ser, Thr, Met. Ala, Asp, Asn, Glu, Gin, Lys. Arg, Pro, CMCys

Очень медленное отщепление Asp, Glu, Gly, CMCys, CysSO.H Gly

Не отщепляются Pro, HyPro, Arg HyPro

* MetSOs метионнясульфон

Все аминокислоты по скорости отщепления их карбоксипепти-дазами А и С могут быть разделены на 4 группы (табл. ?),

Оптимальное значение рН для пептидазной активности составляет 7,0 9,0. оно меняется в зависимости от субстрата. Так, скорость отщепления С-концевых дикарбоиовых аминокислот возрастает при снижении рН, тогда как скорость отщепления лизина возрастает при увеличении рН свыше 9,0.

Карбоксипептида ia В катализирует отщепление основных аминокислот (ли in на и ар "инина). Пептидная связь, образованная остатком аргинина, гидролизуется быстрее, чем связь, образованная остатком лизина. Для пептидазной активности оптимальное значение рН равно 8,0 — 9,0.

Карбоксипептидаза Y отщепляет практически все аминокислоты, включая пролин, и ее специфичность аналогична специфичности С PC. Гидролиз проходит наиболее эффективно при рН 5,5 — 6,5. Оптимальное значение рН для отщепления лизина и аргинина — 7,0.

Как и другие карбоксипептндазы, CPY наряду с пептидазной обладает и эстераз-ной активностью. Кроме тога CPY присуща также амидазная активность, т. е. фер-мент может быть использован и для анализа пептидов, концевая карбоксильная группа которых амидирована.

С-Концевая аминокислотная последовательность определяется следующим образом: субстрат инкубируется с ферментом при 25 37 С и через определенные интервалы времени из реакционной смеси отбираются аликвотные части, реакция останавливается подкислением и количество отщепленных аминокислот определяется на аминокислотном анализаторе. Построив график зависимости количества отщепленных аминокислот от времени (рис. 22), можно определить С-концевую последовательность. Таким образом удается установить последовательность до 5 аминокислотных остатков.

Успешное определение структуры С-концевых участков пептидов и белков в значительной степени зависит от рационального выбора фермента и условий проведения процесса. Выбор карбоксипептида-зы обусловливается природой исследуемого пептида. Очевидно, что

при анализе триптических пептидов, содержащих основные амино- 69 кислоты в качестве С-концевых остатков, целесообразно применять ~ ~ СРВ или смесь CPA и СРВ. Для идентификации С-концевых остат- Строение белков и пептидов ков химотриптических пептидов используют, как п

страница 10
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.11.2017)