, использующей энергию высокоэнергетического интермедиата (рис. 1.11, Б).

2. АТР-синтетаза должна работать как обратимая протонпере-носящая AT Раза

Добавка небольших количеств АТР к суспензии анаэробных митохондрий приводила к выбросу протонов; затем наблюдался медленный спад протонного градиента. Этот спад можно было ускорить, добавив разобщители (Mitchell, Moyle, 1968). Очищенные АТР-синтетазные комплексы, встроенные в липосомы, также катализировали перенос протонов (Kagawa et^al., 1973;

разд. 7.4). Гидролиз АТР может поддерживать Ацн+ более на мембране 200 мВ (Nicholls, 1974). Искусственно созданный мембранный потенциал способен поддерживать синтез АТР (Jagendorf, Uribe, 1966).

3. Сопрягающие мембраны должны иметь низкую протонную проводимость

Вывод о низкой проницаемости мембраны для протонов следует из опытов, где наблюдалась корреляция между действием различных агентов, повышающих протонную проводимость ис-

Хемиосмотический принцип энергетического сопряжения

27

кусственных бислойных мембран, и их разобщающим действием на митохондриях. Протонная проницаемость была измерена более прямо в опытах Митчелла и Мойл (Mitchell, Moyle, 1967b), где определялась скорость спада искусственно созданного градиента рН за счет входа протонов в матрикс митохондрий.

4. Сопрягающие мембраны должны содержать специфические обменные переносчики, позволяющие метаболитам проникать через мембрану и сохранять осмотическую стабильность в условиях высокого мембранного потенциала

Спад АрН, наступающий после прекращения дыхания, ускоряется такими анионами, как сукцинат, фосфат, малонат, а также катионом Na+ (Mitchell, Moyle, 1976b). Транспорт этих анионов происходит, по-видимому, вместе с протоном, a Na+ переносится в обмен на протон. Измерения скорости набухания недышащих митохондрий в присутствии солей аммония позволили Чеппеллу и сотрудникам (Chappell, Crofts, 1966; Chappell, Haarhoff, 1967; Chappell, 1968) показать, что целый ряд переносчиков транспортирует анионы как незаряженные частицы либо вместе с протонами, либо в обмен на другие анионы (разд. 8.3; Mitchell, Moyle, 1969b).

Второй важнейшей проблемой, обсуждаемой в связи с хемиосмотической гипотезой, является вопрос о степени дел'окали-зованности протонных токов и о выходе протонов из мембраны в водную фазу. Предположения о существовании локальных протонных циклов были высказаны рядом авторов (Rottenberg, 1975; Kell, 1979) на основании данных по соотношению скоростей

дыхания, фосфорилирования и величины Au.w- Это соотношение иногда не соответствовало предсказаниям модели делокализо-ванного протонного градиента. Есть, однако, и контраргументы, указывающие на существование протонного цикла, делокализо-ванного по всей органелле. Так, например, одна молекула протонного переносчика грамицидина (разд. 2.5) может вызвать заметное разобщение по всему хлоропласту (Junge, Witt, 1968). В галофильных бактериях (разд. 6.6) бактериородопсиновые протонные помпы собраны в специальных областях мембраны и далеко отстоят от АТР-синтетазных комплексов.

Несмотря на то что противоречия в этом вопросе еще не разрешены, мы, следуя принципу из двух объяснений выбирать более простое, будем придерживаться концепции делокализован-ного хемиосмотического сопряжения.

Третий главный вопрос, о механизме работы протонных помп, остается открытым и не будет решен окончательно, пока мы не исследуем окислительно-восстановительные реакции в комплексах дыхательной цепи в той же степени, в какой сейчас изучена

28 Глава 1

реакция оксигенации гемоглобина. В гипотезе Митчелла о транслокации групп предъявляется ряд требований как к стехиометрии переноса протонов, так и к последовательности расположения переносчиков в цепи (разд. 4.3 и 5.4). В настоящее время (1981 г.) эта гипотеза находит большую поддержку среди исследователей в области бактериального и фотосинтетического сопряжения, чем у специалистов, изучающих работу митохондри-альной электронпереносящей цепи и АТР-синтетазы.

В заключение еще раз отметим, что основной постулат хемиосмотической гипотезы опирается на большой экспериментальный материал. Именно на этой основе будет строиться изложение в нашей книге.

Глава 2

транспорт ионов через сопрягающие мембраны

2.1. ВВЕДЕНИЕ

Возникновение хемиосмотической гипотезы вызвало значительные перемены в подходе к изучению процессов, связанных с транспортом ионов. Из области исследования вторичных явлений, побочных реакций энергетического сопряжения, изучение энергозависимого транспорта ионов превратилось в центральную проблему биоэнергетики. Так, в частности, после сравнения действия ионофоров и жирорастворимых ионов на сопрягающие мембраны и на искусственные липидные бислой был сделан вывод о первичной роли в сопряжении трансмембранного потенциала. В этой главе мы рассмотрим основные свойства проницаемости мембран и действие ионофоров, создающих дополнительные специфические пути проникновения для ионов.

2.2. СТРУКТУРА СОПРЯГАЮЩИХ МЕМБРАН

(Обзор: De Pierre, Ernster, 1977)

Жидкостно-мозаичная модель структуры мембран (Singer, Nicolson, 1972) очень хорошо объясняет свойства сопрягающих мембран (рис. 2.1). Согласно этой модели, основная часть фосфолипидов в мембране образует бислой, в котором полярные головки молекул обращены в водную фазу. Мембранные белки могут быть как периферическими (внешними), так и интегральными (внутренними) в зависимости от глубины их размещения в гидрофобной области бислоя. Некоторые интегральные белки пересекают мембрану от одного ее края до другого, что позволяет им катализировать трансмембранный транспорт. В этой главе мы остановимся на различиях между транспортом, катализируе-

Транспорт через бислой

Транспорт, катализируемый белком

Рис. 2.1. Жидкостно-мозаичная модель мембраны. Согласно этой модели, транспорт веществ может происходить как через бислойные, так и через белковые участки. Свойства этих двух путей транспорта сильно различаются.

Транспорт ионов через сопрягающие мембраны

31

мым белками, и транспортом через бислойные участки мембраны.

Хотя жидкостно-мозаичную структуру мембраны обычно представляют в виде белковых «айсбергов», плавающих в липид-ном море, в случае сопрягающих мембран это не совсем так. Благодаря высокому содержанию белков (50% внутренней ми-тохондриальной мембраны составляют интегральные белки, 25%—периферические и 25%—липиды) эти мембраны имеют относительно плотную упаковку. Бислойные участки составляют менее 60% мембраны. Различные сопрягающие мембраны имеют несколько разный липидный состав: 10% липида внутренней мембраны митохондрий составляет кардиолипин; в случае мембраны тилакоидов хлоропластов фосфолипиды составляют лишь 10% липидов, остальные — это галактолипиды (40%), сульфоли-пиды (4%) и фотосинтетические пигменты (40%). Несмотря на такие различия липидного состава, свойства бислойных участков различных мембран в отношении исходной и индуцированной ионофорами проницаемости достаточно сходны. Это позволяет использовать для их описания данные, полученные на искусственных бислойных мембранах. В то же время свойства белковых транспортных систем могут быть уникальными не только для данных органелл, но и для данной ткани. Так, например, внутренняя мембрана митохондрий из печени крысы содержит транспортные системы, которых нет в митохондриях из ее сердечной мышцы (разд. 8.3).

2.3. ПУТИ ИОННОГО ТРАНСПОРТА

Для транспорта иона через мембрану необходимо существование как пути переноса, так и движущей силы. Движущей силой может служить концентрационный градиент, электрический потенциал, метаболическая энергия или комбинация этих факторов (эти вопросы мы обсудим в гл. 3). В данной главе мы рассмотрим природные и искусственные пути переноса ионов в сопрягающих мембранах.

При изучении любого транспортного процесса возникает ряд вопросов.

а) Пересекает ли данный ион мембрану сам по себе, или его транспорт сопряжен с движением другого иона (рис. 2.2)?

Транспортный процесс, в котором участвует один ион, называют унипортом. Примерами унипорта являются перенос Са2+ через внутреннюю мембрану митохондрий (разд. 8.4) или перенос протона в бислоях при добавлении таких протонных переносчиков, как динитрофенол (разд. 2.5). Транспортный процесс, требующий сопряженного переноса двух или более ионов в од-

32 Глава 2

А (1) Унипорт

(2) Симпорт

(3) Антипорт

'Лактоза

Б (1) Электронейтральны и перенос

-- па

-rl—-Na+

или

НАс-0-«-НАс

(2) Электрогенный перенос

или

; ADP3"

В (1) Перенос, не сопряженный непосредственно

с метаболизмом, например любой из вариантов А и Б (2) Перенос, сопряженный с метаболизмом

Субстрат

Рис. 2.2. Классификация систем транспорта ионов.

ном направлении, называют симпортом или котранспортом. В ряде случаев наблюдается симпорт метаболитов с протоном через плазматическую мембрану бактерий (разд. 8.5). Транспорт ионов, жестко сопряженный с переносом других веществ в про-

Транспорт ионов через сопрягающие мембраны

33

тивоположном направлении, называют антипортом или обменной диффузией. Примерами могут служить Ыа+/Н+-антипорт во внутренней мембране митохондрий (разд. 2.6) и К+/Н+-антипорт, катализируемый ионофором нигерицином в бислоях (разд. 2.5). Если одним из ионов, участвующих в обменном транспорте, оказывается Н+ или ОН-, то обычно невозможно отличить симпорт вещества с Н+ от антипорта с ОН-. Например, перенос фосфата в митохондриях может быть представлен и как Рг/ОН--анти-порт, и как H+/Pi--cHMnopT (разд. 7.5).

б) Связаны ли сопряженные друг с другом движения ионов с переносом заряда через мембрану (рис. 2.2)?

Если в результате транспорта веществ через мембрану заряд не .переносится, то такой транспорт называют электронейтральным. Транспорт может быть электронейтральным при переносе незаряженного вещества, при симпорте катионов и анионов или при антипорте двух ионов равного заряда. Примером последнего является К+/Н+-антипорт, катализируемый нигерицином. Транспорт, связанный с переносом заряда, обычно называют элсктрогенным («создающим