Биологический каталог




Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию

Автор Д.Д.Николс

, используются затем для фиксации С02 в темновых реакциях цикла Кальвина, которые протекают в строме.

На первый взгляд кажется, что структуры хлоропластов и митохондрий сильно различаются, однако в действительности существенное различие между ними состоит лишь в том, что тилакоиды, в отличие от митохондриальных крист, отделены от внутренней мембраны. Таким образом, пространство внутри

16 Глава 1

А

Рис. 1.6. Препараты, получаемые из хлоропластов. А. Интактный хлоропласт. Б. Ламеллярная система в разрушенном хлоропласте. Отметим, что мембрана тилакоидов остается интактной.

тилакоидов представляет собой отдельный компартмент, тогда как пространство внутри крист является продолжением межмембранного пространства митохондрий.

Хлоропласты получают с помощью мягкой гомогенизации листьев в изотоническом растворе сахарозы или сорбитола при рН 8,0. Благодаря такому рН компенсируется закисление среды при разрушении вакуолей. После фильтрования через муслин гомогенат центрифугируют при небольших скоростях для отделения обломков клеток. Хлоропласты обычно осаждают центрифугированием при 1000—2000 g в течение 4 мин. Эта процедура позволяет получать хлоропласты с интактными внутренней и наружной мембранами (интактные хлоропласты). Такие хлоропласты способны с высокой скоростью фиксировать С02, так как в них сохраняется содержимое стромы, однако они редко используются в биоэнергетических исследованиях, поскольку многие субстраты и ингибиторы не проникают через мембрану хлоропласта и не могут достичь мембраны тилакоидов. Исследования функций тилакоидов можно проводить на хлоропластах, полученных в 0,35 М NaCl. В них разрушены наружная и внутренняя мембраны, и они неспособны фиксировать С02, но здесь тилакоиды доступны для субстратов и ингибиторов (разрушенные хлоропласты) .

Хемиосмотический принцип энергетического сопряжения

IT

1.3.4. ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ И ХРОМАТОФОРЫ

(Обзор: Clayton, Sistrom, 1979)

Существуют три группы прокариот, способных катализу ровать фотосинтетический перенос электронов, — это зеленые бактерии, пурпурные бактерии и цианобактерии (или сине-зеленые водоросли). Пурпурные бактерии разделяют на две группы: Rhodospirillaceae (или несерные) и Chroniatiaceae (или серные). Цианобактерии способны катализировать нециклический перенос электронов (разд. 6.4), используя в качестве донора электронов воду, и в этом отношении они сходны с хлоропласта-ми. Из перечисленных выше групп организмов наиболее интенсивно изучается биоэнергетика пурпурных бактерий. Это происходит по двум причинам. Во-первых, механическое разрушение этих клеток (например, при продавливании суспензии под очень высоким давлением через узкое отверстие в ячейке пресса Френча) позволяет получить замкнутые пузырьки внутренней мембраны, которые называют хроматофорами (рис. 1.7). Хроматофоры сохраняют способность к фотосинтетическому сопряжению и имеют ту же ориентацию мембраны, что и субмитохондриальные частицы. Они служат наиболее удобным объектом для изучения цепи переноса электронов и хемиосмотического сопряжения. Второе преимущество пурпурных бактерий состоит в том, что из них могут быть выделены так называемые реакционные центры— первичные фотохимические комплексы (разд. 6.2).

Кроме перечисленных групп бактерий широко распространен-

Разрушение клетки, например растиранием

Рис. 1.7. Препараты из фотосинтезирующих бактерий. А. Пурпурная бактерия. Б. Хроматофор.

18 Глава 1

ным объектом исследования в биоэнергетике служат некоторые галофильные виды. Они имеют уникальную систему энергообеспечения, в которой в качестве светозависимой протонной помпы функционирует единственный белок — бактериородопсин (разд. 6.6).

1.3.5. РЕКОНСТРУИРОВАННЫЕ СИСТЕМЫ

¦ Ь о--

н+

Рис. 1.8. Некоторые системы для реконструкции протонпереносящих ¦комплексов. А. Диализ. Суспензию смеси комплексов с природными или синтетическими фосфолипидами в холате медленно диа-лизуют, чтобы убрать детергент. Б. Обработка ультразвуком. Смесь комплексов и фосфолипидов обрабатывают ультразвуком в отсутствие детергентов. Образуются однослойные липосомы. В. Бислой на миллипоре. Бислойные участки, содержащие комплексы, образуются в порах . мембранного фильтра, так что общая площадь плоской мембраны оказывается очень большой. Г. Липосомы сливаются с бислойной («черной») плоской мембраной, что позволяет проводить прямые измерения электрического потенциала.

(Обзоры: Kagawa, 1972; Rac-ker, 1975)

Важнейшее положение хемиосмотической теории состоит в том, что система окислительного фосфорилирования может быть функционально и структурно разделена на окислительные и фосфорилирующие протонперено-сящие комплексы. Такое же разделение возможно и в случае фотосинтетического фосфорилирования. После разделения очищенные протонные помпы можно встроить в искусственные замкнутые мембранные пузырьки и наблюдать их протонперенося-щую активность. Подобная реконструкция позволяет, во-первых, проверить различные аспекты хемиосмотической теории. (Все ли комплексы, участвующие в трансформации энергии, переносят протоны? Способен ли каждый из таких комплексов переносить протоны самостоятельно или только в сочетании с какой-то гипотетической протонной помпой?) Во-вторых, реконструкция позволяет определить состав минимальной функционирующей единицы, что является первым шагом на пути изучения механизма работы протонной помпы.

Мембранные комплексы выделяют обычно после солюбилиза-ции с помощью неденатурирую-щих детергентов (разд. 5.5). Затем их можно реконструировать

Хемиосмотический принцип энергетического сопряжения

19

в виде искусственных мембран различной структуры (рис. 1.8). Обработка смеси комплексов с фосфолипидами ультразвуком приводит к образованию монослойных мицелл или липосом (рис. 1.8, Б). С помощью другого метода суспензию комплексов и липидов, содержащую также желчные соли (холат, деэоксихолат), диализуют против буфера, что приводит к медленному понижению концентрации детергента (холата) и образованию многослойных липосом (рис. 1.8, А). Липосомы можно затем приклеивать к плоскому липидному бислою и проводить прямые измерения электрического потенциала (Drachev et al, 1974; рис. 1.8, Г). Такой плоский бислой можно создать также, пропитав липидами миллипоровый фильтр (Skulachev, 1976; Blok et al, 1977; рис. 1.8, В).

В связи с различной ориентацией реконструированных комплексов в мембране возникает ряд проблем. Иногда значительная кривизна поверхности мембраны приводит к тому, что все белки в ней ориентированы одинаково, однако чаще всего ориентация носит случайный характер. Чтобы предотвратить работу помп в противоположных направлениях, используют не проникающие через мембрану субстраты. В этом случае активными оказываются лишь те ферменты, которые ориентированы своими субстратсвязывающими центрами наружу.

1.4. ПРЕДПОСЫЛКИ ХЕМИОСМОТИЧЕСКОЙ ГИПОТЕЗЫ

(Обзоры: Mitchell, 1966, 1968, 1976b, 1979 а, b; Greville, 1969)

В этом разделе мы кратко рассмотрим взаимоотношения между хемиосмотической и другими гипотезами энергетического сопряжения в той последовательности, как они развивались после появления первой публикации Митчелла (Mitchell, 1961). При таком подходе возникают две проблемы: во-первых, предполагается, что читатель знаком с основами биоэнергетики, и, быть может, начинающие в этой области предпочтут пропустить этот раздел, пока различные концепции не станут им более понятными; во-вторых, многие читатели, достаточно знакомые с основами, могут не согласиться с интерпретацией автора. Во всяком случае, мы хотели бы вслед за Гревиллом сохранить «доброжелательный, но строгий» взгляд на хемиосмотическую гипотезу (Greville, 1969).

К началу 60-х годов были установлены все основные пути превращения энергии в митохондриях (Ernster, Lee, 1964). Неизвестной оставалась лишь природа центрального переносящего энергию интермедиата. Каждая из выдвигавшихся в это время гипотез энергетического сопряжения должна была учитывать ряд основных наблюдений:

а) Дыхательная (или электронпереносящая) цепь представ-

20 Глава 1

ляет собой линейную последовательность переносчиков электронов, включающую три различных участка, на которых энергия окисления может использоваться для синтеза АТР.

б) Скорость дыхания снижается, если не происходит синтез АТР (дыхательный контроль).

в) Сопряжение между дыханием и синтезом АТР может быть нарушено целой группой агентов, названных разобщителями, которые нарушают дыхательный контроль (т. е. стимулируют дыхание в отсутствие синтеза АТР) и стимулируют гидролиз АТР в митохондриях.

г) Антибиотик олигомицин (разд. 7.2) ингибирует как синтез, так и стимулируемый разобщителями гидролиз АТР.

д) Энергия, выделяемая при дыхании, может использоваться не только для синтеза АТР, но и для накопления Са2+ и для восстановления NAD+ и NADP+.

е) Те же энергозависимые процессы могут происходить за счет гидролиза АТР в анаэробных условиях, причем они ингиби-руются как разобщителями, так и олигомицином.

Функционирование всех путей передачи энергии (рис. 1.9,Л) можно объяснить, если постулировать " существование общего переносящего энергию интермедиата, который принято обозначать значком «~». Единственным примером биоэнергетического механизма, включающего подобный интермедиат, служит субстратное фосфорилирование, катализируемое глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и фосфоглицераткиназой в гликолизе (рис. 1.10). В этих реакциях окисление субстратов приводит к образованию связи фермента с фосфатом. Эта так называемая макроэргическая связь имеет очень высокую свободную энергию гидролиза. Затем фосфат может быть перенесен на ADP. В случае приложения этой схемы «химического сопряжения» к митохондриям (Slater, 1953) требовалось лишь учесть следующие экспериментальные данные. Во-первых, то, что во всех трех «пунктах сопряжения» образуется единый общий интермедиат, и,

NADH-----«-0. NADH

\1/

ТрансгиЬроге^^у- ^=^^2^ ГРа»сгиЭро^а^Ы =^ ?™

/ —If- Олигомицин / —t- Олигомицин

Разобщители Разобщители

ADP + Р1 === АТР ADP + Р! АТР

страница 3
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Скачать книгу "Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию" (1.67Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.09.2017)