Биологический каталог




Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию

Автор Д.Д.Николс

ислота является неконкурентным ингибитором транслоказы.

Клингенбергом (Klingenberg, 1979а) была предложена модель функционирования транслоказы, согласно которой она может существовать в двух состояниях, которые различаются ориентацией единственного нуклеотидсвязывающего центра . (Рис- 7.10). Состояние «Ц», в котором этот центр доступен со стороны цитоплазмы, фиксируется карбоксиатрактилатом, а состояние «М» — бонгкрековой кислотой.

Для того чтобы идентифицировать во внутренней мембране

АТР-синтетаза

159

Цитозоль Матрикс Цитозоль Матрикс

Ц-состояние М-состояниё (связывается (связывается карбоксиатрактилат) . бонгкрековая кислота)

Рис. 7.10. Модель работы транслоказы адениновых нуклеотидов (Klingenberg, 1979а).

митохондрий пептид, ответственный за перенос адениновых нуклеотидов, были использованы два подхода. Первый подход основан на выделении комплекса 355-карбоксиатрактилата с митохондриями сердца быка. Комплекс оказался очень стабильным: он не распадался после солюбилизации мембраны с помощью неионного детергента тритона Х-100 и при последующей очистке. Ингибитор позволяет идентифицировать пептид и защищает его от инактивации при выделении. Практически вся метка в этих опытах оказывается связанной с белком с мол. массой ~30 ООО—40 000. Второй подход основан на использовании фотоаффинных аналогов адениновых нуклеотидов, которые в темноте связываются с активным центром переносчика и являются конкурентными ингибиторами транспорта. После освещения ультрафиолетовым светом от них отщепляется N? и образуется очень активный свободный радикал нитрена, который ковалентно связывается с ближайшим пептидом, т. е. в данном случае с транслоказой.

160 Глава 7

Нуклеотидсвязывающий белок имеет мол. массу ~ 30 ООО. Количество меченых нуклеотидов, связавшихся с белком, указывает на то, что интактная транслоказа работает в виде диме-ра с мол. массой 60 000. В митохондриях сердца транслоказа является наиболее массовым белком внутренней мембраны.

В отсутствие мембранного потенциала транслоказа переносит АТР и ADP симметрично (т. е. с равной эффективностью в обоих направлениях). Однако в условиях нормального дыхания происходит преимущественно захват ADP и выброс АТР, что соответствует физиологическому направлению обмена. Эта асимметрия определяется разницей в величине заряда двух нуклеотидов. АТР транспортируется в форме АТР4-, a ADP — в форме ADP3-. Такое неравенство зарядов означает, что равновесие реакции обмена изменяется в 10 раз на каждые 60 мВ мембранного потенциала (рис. 7.11).

Полная система синтеза АТР в митохондриях и его экспорта, включающая АТР-синтетазу, транслоказу адениновых нуклеотидов и фосфатный переносчик, показана на рис. 7.12. Совместное действие фосфатного переносчика и транслоказы адениновых нуклеотидов приводит к переносу в матрикс одного

60 80 100 120 140 160 AV. мВ

Рис. 7.11. Влияние мембранного потенциала на равновесие обмена адениновых нуклеотидов с помощью транслоказы (KHngenberg, Rottenberg, 1977). Если при обмене ADP на АТР происходит суммарный перенос одного заряда, то можно предсказать (разд. 3.5), что соотношение ATP/ADP в матриксе будет понижаться по сравнению со средой в 10 раз на каждые 60 мВ мембранного потенциала в условиях равновесия. Это было проверено Клинген-бергом и Роттенбергом (KHngenberg, Rottenberg, 1977). Митохондрии инкубировали в среде, содержащей валиномицин, и Дгр определяли по распределению 88Rb+ (разд. 4.2). Среда содержала 14C-ATP, 14C-ADP, олигомицин, блокирующий АТР-синтетазу (разд. 7.2), и сукцинат в качестве субстрата дыхания. Д\|) варьировали от 60 до 170 мВ, изменяя концентрацию К+ в среде от 20 до 0,5 мМ. После того как устанавливалось равновесное распределение адениновых нуклеотидов, митохондрии выделяли из инкубационной среды с помощью центрифугирования через силиконовое масло (рис. 4.5). Затем определяли содержание АТР и ADP в среде и в митохондриях. Различие в соотношении ATP/ADP в среде и матриксе возрастало при увеличении Д\|), и при Дф, равном 160 мВ, соотношение ATP/ADP в среде было в 125 раз выше, чем в матриксе.

АТР-синтетаза

161

Цитозоль

Матрикс

Рис. 7.12. Перенос ADP и Pi в матрикс и выброс АТР сопровождаются переносом одного дополнительного протона. (Для простоты антипорт Pi /ОН-показан как эквивалент симпорта H+/P0

АТР-синтетаза ADPM + Рй«) + 2Н?> АТР(«> + 2НМ

Транспорт фосфата РГ(ц)+н+> -> р-(м) + н+м)

Транслоказа ADP^ + ATP^ -> ADP^ + АТР^

Суммарно ADP3- + РГ(Ц) + ЗН+Ц) + АТР? + ЗН+

Индексы означают: м — матрикс, ц — цитозоль.

дополнительного протона на каждую синтезированную молекулу АТР. Этот протон переносится совместно с Pi электронейтрально. Для поддержания асимметрии электрогенного обмена ADP3- на АТР4- используется заряд еще одного протона.

Такое протекание суммарного процесса приводит к важным термодинамическим последствиям. Во-первых, треть свободной энергии, накапливаемой в цитоплазматической пуле ATP/ADP + Pi, поступает не от собственно АТР-синтетазы, а в результате протекания последующих транспортных процессов. Во-вторых, поскольку для синтеза цитоплазматического АТР используются три протона, а для АТР в матриксе лишь два, AGP в цитоплазме в состоянии 4 (разд. 3.2) может превышать на 50% AGp, поддерживаемый в матриксе или при работе вывернутых субмитохондриальных частиц. Действительно, было установлено, что в изолированных митохондриях AGp достигает 64 кДж-моль-' (Slater et al., 1973), а в случае субмитохондриальных частиц не превышает 50 кДж-моль-1. Тот факт, что для синтеза АТР используются три протона, необходимо учитывать при рассмотрении гипотетических механизмов переноса протонов в дыхательной цепи (разд. 4.3).

Глава 8

взаимоотношения между биоэнергетическими органеллами и окружающей их средой

8.1. ВВЕДЕНИЕ

Биоэнергетические органеллы функционируют лишь в условиях постоянного обмена метаболитами и конечными продуктами с цитоплазмой клетки (в случае митохондрий и хлоропластов) или с внешней средой (в случае бактерий). Кроме того, органеллы регулируют свой ионный состав и одновременно поддерживают высокий Дил+, необходимый для синтеза АТР. Совместное осуществление этих функций достигается благодаря работе систем переносчиков ионов и метаболитов. Их мы и рассмотрим в этой главе.

8.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ТРАНСПОРТА МЕТАБОЛИТОВ

(Обзоры: Palmieri, Kl'ngenberg, 1979; La None, Schoolv/erth, 1979)

Данный раздел посвящен прежде всего методам исследования транспорта метаболитов в митохондриях. Здесь следует отметить, что эти методы приложимы также и к другим системам.

Основные методические проблемы при изучении органелл связаны с тем, что скорости транспортных процессов! в них высоки, а внутренний объем мал. Если большинство транспортных процессов через плазматическую мембрану эукариогической клетки имеет характерные времена порядка нескольких часов, то транспорт через внутреннюю мембрану митохондрий (как однонаправленный, так и обменный) достигает стационарного состояния в течение нескольких секунд.

Один из быстрых качественных методов определения транспорта метаболитов основан на измерении осмотического набухания матрикса при. накоплении в нем растворимых веществ (разд. 2.7). Если недышащие митохондрии суспендированы в изоосмотической среде, то их набухание и последующее снижение светорассеяния будут наблюдаться лишь при условии одновременного транспорта аниона и катиона и соблюдении баланса зарядов и рН (разд. 2.7). Накопление метаболитов часто связано с симпортом протонов. В этом случае закисление матрикса можно предотвратить, добавляя соли аммония: NH3 является проникающим веществом (разд. 2.4), а после протониро-вания в матриксе образуется NH*. который не проникает через мембрану.

164 Глава 8

Малат

Pi Малат

КН^модат Ш^цитрат

Среда Мембрана Матрикс

NH3—pNH?

Цитрат

Цитрат3

Рис. 8.1. Аммонийное набухание и перенос метаболитов в митохондриях.

Метод «аммонийного набухания» был разработан Чэппел-лом (Chappell, 1968) для изучения электронейтральных транспортных систем. Было показано, что транспорт фосфата (разд. 7.6) эквивалентен симпорту Н+/Н2РО^ (рис. 8.1), так как в присутствии фосфата аммония наблюдалось быстрое набухание. Набухание в присутствии малата аммония наблюдалось лишь при наличии в среде Pi, что свидетельствует о связи между фосфатным переносчиком и фосфат-малатным обменом. Для набухания в присутствии цитрата аммония требуется как Pi, так и малат, что указывает на трехстадийную систему обмена.

Метод набухания трудно использовать для количественных измерений транспорта. Он требует очень высоких (изоосмотиче-ских) концентраций анионов. Более прямой метод; позволяющий обойти эти трудности, основан на измерении транспорта

Взаимоотношения между органеллами и средой

165

или обмена меченых метаболитов между внешней средой и мат-риксом митохондрий. Высокая скорость, с которой выравниваются концентрации метаболитов в матриксе и внешней среде, требует применения быстрых методов для изучения кинетики транспорта. Чаще других используют технику центрифугирования органелл через силиконовое масло (рис. 4.5). Временное разрешение метода можно повысить, если останавливать транспорт перед центрифугированием добавлением специфического ингибитора. С помощью этого подхода можно достичь временного разрешения менее одной секунды. В настоящее время разработаны автоматические системы, позволяющие последовательно отбирать ряд образцов из инкубационной смеси и определять таким образом кинетику транспорта.

Большинство митохондриальных транспортных систем катализирует обменные реакции. Поэтому, чтобы получить достоверные результаты по транспорту метаболита, необходимо предварительно нагрузить митохондрии веществом, на которое он обменивается.

8.3. ПЕРЕНОСЧИКИ МЕТАБОЛИТОВ В МИТОХОНДРИЯХ

(Обзоры: Meijer, Van Dam, 1974; La Noue, Schoolwerth, 1979)

В табл. 8.1 приведен список основных переносчиков метаболитов, которые были обнаружены во внутренней мембране митохондрий; однако, возможно, этот список не полон. Транслок

страница 29
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Скачать книгу "Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию" (1.67Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.07.2017)