Биологический каталог




Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию

Автор Д.Д.Николс

азерной флеш-спектрометрии удалось различить целый ряд интермедиатов. Единственной группой белка, для которой в настоящее время установлено, что в фотоцикле происходит ее обратимое протони-рование и депротонирование, является шиффово основание, связывающее ретиналь с белком (рис. 6.12). Оно протонировано в исходном пигменте и депротонировано в «М-форме».

Пока Митчелл жонглирует протонами и зарядами, Слейтер пытается поймать неуловимый интермедиат, а Бойер создает конформационное напряжение, Рэкер собирает холодолабильную Fi-АТРазу.

Глава 7

атр-синтетаза

7.1. ВВЕДЕНИЕ

АТР-синтетаза является универсальным компонентом сопрягающих мембран. Она присутствует в митохондриях, в хлоропластах, в аэробных и фотосинтезирующих организмах и даже в тех бактериях, которые лишены функциональной дыхательной цепи и существуют за счет гликолиза (разд. 4.7). АТР-синтетаз-ный комплекс имеет сходное строение во всех мембранах и сильно отличается от других АТР-зависимых ионных помп, таких, как Na+, К+-АТРаза из плазматической мембраны эукарио-тических клеток или Са^-АТРаза, отвечающая за накопление Са2+ в цистернах саркоплазматического ретикулума. АТР-синтетаза сопрягающих мембран использует энергию Аи.н+ для поддержания концентрации АТР, отличающейся от равновесной по крайней мере на семь порядков величины. В случае анаэробных

бактерий она использует АТР для поддержания Ди.н+, необходимой для транспортных процессов.

7.2. СТРУКТУРА АТР-СИНТЕТАЗЫ

[Обзоры: Senior, 1973; Pedersen, 1975; Ra'cker, 1975, 1976; Penefsky, 1979 (митохондрии); Nelson, 1976; Junge, 1977; Sha-vii, 1980 (хлоропласты); Kagawa, 1978; Downie etal., 1979 (прокариоты)].

АТР-синтетазу можно увидеть в электронный микроскоп в препаратах сопрягающих мембран после негативного контрастирования с помощью фосфовольфрамата. Комплексы выглядят как шляпки грибов, выступающие на одной стороне мембраны. Ориентация шляпок различна:в бактериях и митохондриях они выступают в матрикс или внутриклеточное пространство; в изолированных тилакоидах, хроматофорах или полученных после обработки ультразвуком субмитохондриальных частицах они располагаются снаружи. В любом случае функциональная и структурная ориентации совпадают: АТР гидролизуется или синтезируется на той стороне мембраны, где выступают шляпки, а протоны захватываются при синтезе АТР с той стороны, где шляпок нет (рис. 1.1).

АТР-синтетазный комплекс состоит из по крайней мере девяти различных полипептидов; некоторые из этих полипептидов представлены в нескольких копиях. Важнейшей проблемой является выяснение функций каждого из полипептидов. Комплекс можно разделить на две части: шляпку, которая видна в электронный микроскоп и является каталитическим компонентом

150 Глава 7

комплекса (ее обозначают Fi в митохондриях, CFj в хлоропластах и TFi в термофильных бактериях), и остальную часть комплекса, которая состоит из гидрофобных белков, погруже-Расстояние от старта, см на в мембрану и обеспечивает,

по-видимому, перенос прото-Рис. 7.1. Полипептидный состав ми- нов через мембрану К F,. Гид-тохондриальнои Fi-АТРазы (интен- . <¦ r J -

сивность полос у, б и е увеличена в рофобную часть обозначают 8 раз). F0. Fi можно отделить от F0 и,

следовательно, от мембраны с помощью различных воздействий, таких, как обработка мочевиной, хелатирующими агентами или уменьшение ионНой силы. Изолированный Fi — это растворимый белок с мол. массой ~360 000. Он состоит из 5 (иногда 6) полипептидов (рис. 7.1). Субъединичный состав Fj из различных источников очень сходен. Обычно мол. масса субъединиц, определенная с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН (рис. 7.1), составляет 56 000 (а-субъединица), 53 000 (Р-субъединица), 33 000 (у-субъединица), 16 000 (6-субъедини-ца) и 11000 (е-субъединица). Данные о стехиометрии субъединиц достаточно противоречивы, предполагаются варианты

a2P2Y20l-262 или аэРзубе.

После отделения Fi от мембраны его свойства изменяются. Так, например, изолированный Fj обратимо диссоциирует на холоду с потерей каталитической активности {во всех случаях, кроме чрезвычайно стабильного TFi из термофильной бактерии PS3 (Kagawa et al., 1979)]. Растворимый Fi катализирует гидролиз АТР с очень высокой скоростью. При 25 °С один моль Fi может гидролизовать около 104 молей АТР в минуту. Вместе с тем обратную реакцию — синтез АТР на растворимом Fi — наблюдать не удается. Изолированный Fi не обладает абсолютной специфичностью к нуклеотидам: он катализирует также гидролиз и ITP, и GTP.

Fi можно расчленить, не нарушив его каталитической активности. Так, после обработки CFi трипсином получают комплекс, состоящий лишь из а- и р-субъединиц, но сохраняющий некоторую активность. Фотоаффинные аналоги АТР, которые кова-лентно связываются с белком после освещения ультрафиолетовым светом, оказываются ассоциированными в основном с р-субъединицей (Scheurich et al., 1978). По-видимому, на этой субъединице расположен активный центр фермента. Минорная 6-субъединица, скорее всего, необходима для связывания Fi с F0. Существует природный белковый ингибитор АТРазы, который предотвращает гидролиз АТР при низких значениях Дц.н+-

АТР-синтетаза

151

Активность CFi в деэнергизованной мембране подавлена значительно сильнее, чем в случае митохондр;иального фермента.

Функции индивидуальных субъединиц АТР-синтетазы Е. coli были исследованы генетическими методами с помощью ипс-му-тантов, дефектных по синтезу АТР (Downie et al., 1979; Gibson et al., 1979). Было обнаружено пять генов ипс от А до Е, которые образуют часть оперона в хромосоме Е. coli. Оказалось, что гены ипс А и ипс D кодируют соответственно а- и Р-субъедини-цы Fi; гены ипс В и ипс Е, по-видимому, кодируют компоненты Fo.

Изолированный Fi не может связываться непосредственно с F0 в отсутствие компонента комплекса, который был назван «белком, сообщающим чувствительность к олигомицину» или OSCP (мол. масса 18 000). Олигомицин — это антибиотик, продуцируемый актиномицетами Streplomyces. Он ингибирует АТР-синтетазу, связываясь с одним из компонентов F0 (но не с OSCP). Олигомицин блокирует перенос протонов через F0 (разд. 5.3). В полном комплексе F0-Fi это приводит к подавлению как синтеза, так и гидролиза АТР. Чувствительность к олигомицину может служить хорошим критерием правильного соединения F0 с Fi. Олигомицин эффективен лишь в случае мито-хондриального фермента, что хорошо согласуется с отсутствием OSCP в составе комплекса из хлоропластов и бактерий. В бактериальных и фотосинтетических мембранах аналогично олигомицину действует дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД), однако точки их действия не совпадают.

Как и в случае других мембранных белков, выделение пептидов, образующих

является сложной зада-

чей. Эти пептиды очень гид-рофобны, и поэтому полный комплекс Fo-Fi удается со-любилизировать, лишь полностью разрушив мембрану. После такой солюбилизации комплекс можно разделить на Fi и F0.

F0 из термофильной бактерии PS3 имеет мол. массу 92 000 и состоит из субъединиц трех типов: шести копий ДЦКД-связывающего белка с мол. массой 5400; трех копий TFi-связываю-щего белка (мол. масса 13 000) и одного основного

Активный центр

Рис. 7.2. Возможная модель организации субъединиц в комплексе Fo-Fi (Ra-cker, 1976, с модификациями). Схема является гипотетической; на ней отсутствуют у- и е-субъединицы, так как их расположение неизвестно. OSCP — белок, сообщающий чувствительность к олигомицину (от англ. oligomycin sensitivity conferring protein).

152 Глава 7

Олигомицин

Рис. 7.3. Условия для переноса протонов через мембрану в интактных и лишенных Fi органеллах. Интактная АТР-синтетаза проводит протоны только сопряженно с синтезом АТР (А). Переноса протонов не происходит, если синтез АТР блокирован (Б). В мембранах, лишенных F[ (В), происходит неконтролируемый перенос протонов через АТР-синтетазу, который чувствителен к ингибиторам, действующим на F0, например к олигомицину (Г).

белка, сходного с митохондриальным OSCP (мол. масса 19 000) (Kagawa et al., 1979). Структуру полного комплекса Fi-F0 можно себе представить так, как это показано на рис. 7.2.

7.3. ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ F0

(Обзоры: Kagawa et al., 1979; Fillingame, 1980)

Если от субмитохондриальных частиц отделить Fi, что сделать нетрудно, то такие частицы не только не синтезируют 'и не гидролизуют АТР, но не способны также катализировать любые энергозависимые процессы. При добавлении олигомицина или связывании F] способность к этим реакциям восстанавливается. Эффект отделения Fi от мембраны оказывается аналогичным действию протонофора. Это указывает на то, что F0 в АТР-син-тетазном комплексе создает протонную проводимость между внешней средой и активным центром Fb В норме перенос протонов сопряжен с синтезом АТР, однако после отделения Ft возникает неконтролируемая протонная проводимость, которая не зависит от синтеза АТР, но по-прежнему блокируется олигоми-цином или ДЦКД (рис. 7.3.).

АТР-синтетаза

153

Рис. 7.4. Очищенный F0 обеспечивает протонную проводимость через искусственный фосфолипидный бислой (Okamoto et al., 1977). Высокоочищенный F0 из термофильной бактерии PS3 был суспендирован вместе с фосфолипидами из соевых бобов в растворе, содержащем холат и трициновый буфер. Затем холат удаляли диализом в течение 16 ч. При этом образовывались везикулы (разд. 1.3) с Fo, встроенным в бислой. Везикулы нагружали КС1, инкубируя их при 55°С в среде с КО. Затем их промывали и суспендировали в среде без КС1 в ичейке с рН-электродом (А). После этого добавляли валиномицин, что приводило к образованию диффузионного потенциала за счет выхода К+ по градиенту концентрации и к поглощению Н+ через F0 в ответ на образование потенциала (Б). Сам фосфолипидный бислой имеет очень низкую проводимость для протонов, и в отсутствие Fo наблюдается лишь незначительное поглощение Н+ (В).

Этот вывод был подтвержден опытами, в которых частично очищенный F0 из митохондрий сердца быка (Kagawa et al., 1973) или хорошо очищенный TF0 из термофильной бактерии (Okamoto et al., 1977) при вст

страница 27
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Скачать книгу "Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию" (1.67Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Химический каталог

Copyright © 2009
(28.11.2022)