Биологический каталог




Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию

Автор Д.Д.Николс

-тионитом. В дальнейшем, однако, генетические исследования на митохондриях дрожжей показали, что апобелки обоих цитохромов кодируются одним структурным геном и, следовательно, являются структурно идентичными субъединицами димера. В этом случае различное поведение цитохромов в димере, по-видимому, связано с взаимодействиями мономеров.

Потенциалы полувосстановления цитохромов Ь566 и 6s62 составляют ~—30 и +30 мВ соответственно (рис. 5.11). Оба компонента глубоко погружены в мембрану и недоступны для не-спёцифического акцептора электронов — феррицианида ни в интактных митохондриях, ни в вывернутых субмитохондриальных частицах. Генерация мембранного потенциала при гидролизе АТР или образовании диффузионного потенциала К+ (разд. 3.6) приводит к восстановлению цитохрома Ь5в6 относительно цитохрома Ь562; кажущаяся величина Е^т цитохрома Ь566 возрастает от —40 до +70 мВ. Этот факт указывает на возможное расположение двух компонентов на разных сторонах мембраны. Образование мембранного потенциала приводит к смещению электронов от цитохрома bS62 на внутренней стороне к цитохрому #566 на наружной стороне мембраны.

Кроме цитохромов b комплекс III содержит цитохром с\ и Fe/S-белок с очень высоким положительным зарядом (белок Риске), в котором находятся 2FeS-4eHTpa. В него входит также несколько так называемых структурных белков, которые не участвуют в редокс-переходах, но, возможно, осуществляют перенос протонов. Большое повышение Eh между цитохромами b и с\ указывает на то, что перенос электронов на этом участке

тесно связан с генерацией Дцн+

Цитохром ci, выделенный из митохондрий сердца быка, имеет мол. массу 31 000. В отличие от изолированного белка цитохром с\ in situ нечувствителен к действию трипсина и, по-видимому, является интегральным белком. Цитохром с\ имеет спектр, который можно отличить от спектра цитохрома с лишь при низкой температуре (разд. 5.2). Цитохром с —это периферический белок, связывающийся на наружной стороне мембраны. При наложении мембранного потенциала относительное редокс-состоя-ние цитохромов с и Ci меняется мало. Это указывает на то, что цитохром Ci также расположен вблизи наружной сто-

120 Глава 5

Ц-Фаза

¦ 100

а: d

е

U

о о

Рис. 5.13. Действие, антимицина А и феррицианида на восстановление цитохромов в очищенном комплексе III (Rieske, 1971). Очищенный комплекс III, который находится в растворе благодаря холату, был восстановлен с помощью UQ1H2 [водорастворимый аналог UQioH2 (разд. 5.2)]. Хинон полностью восстановил цитохром С] и лишь на 30°/о_ — цитохромы Ь. Добавление антимицина приводит лишь к небольшим изменениям, однако после добавления феррицианида, который должен окислить весь комплекс, наблюдается окисление цитохрома С\ и частичное восстановление цитохромов Ь. Поскольку хинон был в избытке по отношению к феррицианиду, по мере исчерпания окислителя наблюдалось обращение вызванных им эффектов.

Рис. 5.14. Протоидвижущий Q-цикл (Mitchell, 1975b).

роны мембраны. Между белком Риске и цитохромом й существует быстро устанавливающееся редокс-равновесие.

Комплекс III ингибируется антимицином А в очень низких концентрациях при связывании одного моля ингибитора на моль фермента. Место действия антимицина А точно не известно, так же как не ясен путь переноса электронов в комплексе III. Ингибитор повышает восстановленность цитохромов Ь и предотвращает восстановление цитохрома с\, когда донором электронов служит UQ. При этом увеличивается также потенциалзави-симое перераспределение электронов между цитохромами 6566 и Ь562. В то же время добавление акцептора электронов, такого, как феррицианид, приводит в присутствии антимицина не только к окислению цитохрома сь но и к аномальному восстановлению цитохромов Ь. Этот удивительный эффект не зависит от Дгр и может наблюдаться на изолированном комплексе (рис.

Дыхательные цепи

121

5.13.). Его простейшее объяснение состоит в том, что поток электронов в данных условиях разветвляется:

[X]red Z- (х

е- xfe

Если такой перенос электронов от неизвестного донора к ци-тохромам близок к равновесию в присутствии антимицина А, то окисление цитохрома с\ приведет к сдвигу равновесия в сторону восстановления цитохромов Ь.

Отсутствие второго переносчика Н-атомов, а также аномальное поведение цитохромов в присутствии антимицина А заставили Митчелла модифицировать схему классической «петли» (рис. 4.10) и предположить существование протондвижущего Q-цикла (Mitchell, 1975b), в котором UQ окисляется и восстанавливается в две стадии с образованием свободного радикала сёмихинона UQH (рис. 5.14). Семихинон — это очень реак-ционноспособное вещество, которое быстро дисмутирует с образованием UQ и UQH2. В митохондриях, однако, он стабилизирован за счет окружения и может быть обнаружен по сигналу ЭПР. В рамках Q-цикла сохраняется порядок взаимодействия цитохромов, предложенный выше, а также объясняется аномальное восстановление цитохромов Ъ при окислении цитохрома сл в присутствии антимицина А.

5.9. ЦИТОХРОМ с И КОМПЛЕКС IV

(ЦИТОХРОМ с—ОКСИДАЗА, ФЕРРОЦИТОХРОМ с: О ОКСИДОРЕДУКТАЗА)

[Обзоры: Hatefi, 1978 (выделение); Wikstrom, Krab, 1979 (перенос протонов)]

Комплекс III переносит электроны на цитохром с. Последний нельзя выделить в виде компонента комплекса, поскольку он легко отделяется от цитохром с—оксидазы. Однако выделенный цитохром с способен стехиометрически связываться с цитохром с — оксидазой. Цитохром с представляет собой периферический белок, локализованный на наружной поверхности мембраны, и его легко отделить от интактных митохондрий. Цитохромоксидаза—терминальный комплекс дыхательной цепи — катализирует восстановление 02 до 2Н20 с переносом четырех электронов:

4е- + 4Н+Ч-02-^ 2Н20.

Естественным донором электронов служит цитохром с. Искусственным донором электронов может служить тетраметил-л-фе-нилендиамин (TMPD), который в свою очередь восстанавлива-

122 Глава 5

ется аскорбатом (разд. 4.1). В реакции с переносом четырех электронов участвуют четыре одноэлектронные редокс-группы комплекса: два гема (цитохромы а и аз) и два атома меди, способные восстанавливаться до Си+. Два цитохрома можно различить благодаря специфической способности цитохрома аз связывать такие лиганды, как СО. В то же время, как и в случае цитохромов Ь, неясно, являются ли цитохромы а и аз химически различными молекулами. В отличие от цитохромов Ь и с, где обе непорфириновые координационные связи железа заняты остатками аминокислот, в цитохромах а, как и в гемоглобине, имеется одна свободная координационная связь, что позволяет гему аз связывать Ог и ингибиторы: СО, CN- и N3.

Электроны, поступающие в комплекс, имеют потенциал ?h,7 — ~+290 мВ, если митохондрии находятся в состоянии 4 (рис.

5.11). Затем они передаются на пару^-Ог/НгО, которая в среде,

насыщенной воздухом, имеет Ehj — + 750 мВ. Таким образом, перепад редокс-потенциалов АЕ^7 составляет ~460 мВ. В этих условиях энергия,^выделяемая при переносе двух электронов, достаточна для переноса четырех протонов через мембрану против Дц.н+=230 мВ (разд. 3.8). Хотя давно установлено, что в комплексе IV происходит превращение энергии, вопрос о стехиометрии и механизме переноса протонов остается открытым. В отличие от остальных комплексов дыхательной цепи цитохромоксидаза катализирует реакцию только в одном направлении.

Рис. 5.15. Электронтранспортная модель и модель протонной помпы для цитохромоксидазы. А. Электронтранспортная модель (Mitchell, 1966). Стехиометрия: q+/2e_ = 2; 2Н+/2е~ (поглощение протонов из матрикса); в цито-золь протоны не выбрасываются. Б. Модель протонной помпы (Wikstrom, Krab, 1979): q+/2e-=4(6); 4 (6) Н+/2е-— поглощение из матрикса и 2(4)Н+/2е- — выброс в цитозоль. В. Несмотря на то, что, согласно модели (А), протоны не переносятся через мембрану, транспорт электронов может быть сопряжен с синтезом АТР.

Дыхательные цепи

123

0,8mMFe(CN)e"

+FCCP Л-FCCP

0,8mMFe(CN)6 I

+TCCP\-FCCP\

Валиномицин

2Fe(CN),

2Fe(CN)f"'

2H+

H,0'

2e"

¦ 4H

Рис. 5.16. Перенос протонов цитохромоксидазой (Wikstrom, Krab, 1978). Митохондрии печени крысы добавляли в среду с низкой буферной емкостью, содержащую КС1 (для поддержания осмотического равновесия), валиномицин (для компенсации переноса зарядов при начальном выбросе Н+), роте-нон и антимицин А (чтобы предотвратить перенос электронов на других участках дыхательной цепи). Для восстановления цитохрома с добавляли ферроцианид: после отброса пера самописца, обусловленного этой добавкой, наблюдалось закисление среды (/), которое затем сменялось постоянным защелачиванием (//), так как протоны проникали обратно в матрикс. В присутствии протонофора (///) наблюдалось лишь поглощение Н+. А. Запись с помощью 02-электрода. Б. Запись с помощью рН-электрода. В. Начальные условия. Г. Стационарные условия.

Схемы двух гипотез' о механизме работы комплекса IV представлены на рис. 5.15. Исходное предположение Митчелла состояло в том, что цитохромоксидаза работает как электронпере-носящая ветвь последней редокс-петли (рис. 4.10). В альтерна-

124 Глава 5

тивной гипотезе предполагается, что фермент работает как протонная помпа, в которой перенос протонов через мембрану вызывается конформационными изменениями, возникающими при переносе электронов. Хотя по модели Митчелла переноса протонов не происходит, но перенос электронов может быть сопряжен с синтезом АТР, так как протоны, переносимые в матрикс через АТР-синтетазу, используются в процессе восстановления 02 до Н20 (рис. 5.15).

Наиболее заметное различие между моделями состоит в том, что выброс протонов во внемитохондриальную среду происходит лишь в случае работы протонной помпы (рис. 5.15). На первый взгляд кажется, что это предположение легко проверить, однако для доказательства того, что наблюдаемый выброс протонов связан с их векторным переносом, требуются значительные усилия. На рис. 5.16 показаны результаты одного из экспериментов по проверке этого предположения. Подробное их обсуждение можно найти в работе Мойл и Митчелла (Moyle, Mitchell, 1978b).

страница 22
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Скачать книгу "Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию" (1.67Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.07.2017)