Биологический каталог




Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию

Автор Д.Д.Николс

убстрат—{5-гидроксибутират. Ротенон (1 мкМ) полностью ингибирует дыхание, но не препятствует окислению сукцината. Антимицин А блокирует окисление сукцината, но не аскорбата в присутствии TMPD. Цианид является ингибитором и в последнем случае. Дитионит (S2O4 ) добавлен, чтобы неферментативным путем вызвать аноксию.

потенциалом полувосстановления (Ет) и степенью восстановлен-ности переносчика [уравнение (3.19)]. Последнюю величину легко можно определить спектроскопически, но измерение потенциала полувосстановления in situ возможно лишь с помощью непрямых методов. Надо отметить, что потенциал полувосстановления компонента в составе дыхательной цепи обычно отличается от величины, характерной для очищенного белка в растворе.

Метод редокс-потенциометрии (Dutton, Wilson, 1976; Dutton, 1978) объединяет двухволновую спектроскопию и определение редокс-потенциалов (разд. 3.3). Как и в случае редокс-гютен-

110 Глава 5

циометрии большинства других биологических систем, в исследованиях дыхательной цепи приходится применять промежуточные редокс-пары, которые в низких концентрациях ускоряют установление равновесия между платиновым электродом и первичной парой. Такой медиатор эффективно работает лишь в области своего потенциала полувосстановления, когда и окисленная, и восстановленная формы присутствуют в заметных концентрациях. Поэтому при изучении дыхательной цепи приходится использовать набор редокс-медиаторов, перекрывающих весь диапазон потенциалов с интервалом около 100 мВ. Медиаторы обычно используются в концентрации от 10~6 до Ю-4 М. Многие медиаторы аутооксидабельны, поэтому измерения проводятся в анаэробных условиях. Это позволяет также предотвратить перенос электронов по цепи, нарушающий равновесие.

Для того чтобы уравновешиваться со всеми связанными с мембраной компонентами, медиаторы должны быть проникающими веществами. Особенно большие затруднения возникают при работе с энергизованными митохондриями (например, в присутствии АТР, если поддерживается анаэробиоз). В этих условиях Дф или ДрН могут сказываться на распределении окисленной и восстановленной форм медиаторов по обе стороны мембраны, так что соотношение этих форм на стороне исследуемого компонента цепи будет отличаться от соотношения форм на платиновом электроде. Таким образом, интерпретация АТР-зависи-мых эффектов достаточно сложна. Указанный артефактный эффект следует отличать от истинного эффекта, связанного с перераспределением электронов в мембране в ответ на генерацию мембранного потенциала или с энергозависимым изменением величины Ет (Hinkle, Mitchell, 1970; Walz, 1979).Простейшие эксперименты по редокс-потенциометрии проводятся на де-энергизованных митохондриях или на субмитохондриальных частицах.

Практически определение величины Ет различных компонентов дыхательной цепи производится следующим образом (рис. 5. 10). Митохондрии инкубируют в анаэробных условиях в присутствии вторичных медиаторов. Степень восстановленности исследуемого компонента определяют с помощью двухлучевой спектроскопии, а редокс-потенциал среды измеряют платиновым или золотым электродом. При этом медиатор обеспечивает равновесие между компонентами цепи и электродом при данном значении Eh. Эта величина может быть изменена как в отрицательную сторону (при добавлении аскорбата, NADH или дитионита), так и в положительную при добавлении феррициа-нида. Одновременное измерение величины Еь и степени восстановленности компонента цепи позволяет провести его полное редокс-титрование.

Подобное титрование дает возможность получить очень су-

Дыхательные цепи

111

Выход аргона

Платиновый электрод.

Мешалка

Световой путь

Вход аргона

Каломельный электрод сравнения

Б

Я Ж

J_1-1-U

500 530 560 590

А, нм

Рис. 5.10. Редокс-потенциометрия компонентов дыхательной цепи (Dutton, 1978). А. Прибор для одновременного определения редокс-потенциала и поглощения. Б. Дифференциальный спектр сукцинат: (цитохром с) оксндоредуктазы (т. е. комплексов П + Ш). Комплекс, который поддерживается в растворе благодаря низким концентрациям тритона Х-100 и дезоксихолата, был добавлен в анаэробных условиях в среду инкубации, содержащую редокс-медиаторы. Редокс-потенциал среды варьировали с помощью добавления порций феррицианида. / — спектр при +145 мВ, когда цитохром с, восстановлен (базовая линия при +280 мВ, когда все цитохромы окислены); // — спектр при —10 мВ, когда восстановлен цитохром Ьъы (базовая линия при + 145 мВ, когда восстановлен лишь цитохром с); /// — спектр при —100 мВ, когда восстановлен цитохром 6566 (базовая линия при -—10 мВ, когда восстановлены цитохромы С\ и 6562).

щественную информацию. Кроме собственно измерения потенциала полувосстановления по наклону графика зависимости редокс-потенциала (Eh) от логарифма отношения концентраций окисленной и восстановленной форм можно определить, является ли данный компонент одноэлектронным (60 мВ на изменение [ox]/[red] в 10 раз) или двухэлектронным (30 мВ) переносчиком. Повторяя редокс-титрование при различных рН, можно определить, зависит ли потенциал полувосстановления данного

112 Глава 5

-400г -200 О

' мВ +200

+400

+600

я to.

¦z z zzz

^ ul u_ ii: u_

1 i

1

5>

i г

1 э>

4_

3 >

в ^ a

Л Й ^

il-1

4___У

о,

Рис. 5.11. Значения ?т и Еъ в состоянии 4 для компонентов дыхательной цепи митохондрий (Erecinska et al., 1974; Dutton, Wilson, 1974). Все значения приведены для митохондрий сердца. Величины Ет (--), полученные для

деэнергизованных митохондрий, и Еь (-) — для митохондрий, окисляющих {5-гидроксибутират в состоянии 4, рассчитаны, исходя из значений Ет (в деэнергизованных митохондриях) и степени восетановленности компонентов в состоянии 4. Предполагается, что никаких энергозависимых изменений потенциалов полувосстановления не происходит.

компонента от рН, и, следовательно, переносится ли при его работе (Н++е~). Наконец, этот метод часто позволяет различить два или более компонента с равными ?т в одном спектральном пике. В этом случае кривая титрования представляет собой сумму двух нернстовых кривых (рис. 3.3) с различными величинами Ет. Одно из наиболее интересных открытий, сделанных с помощью этого метода, состояло в том, что цитохром Ь в комплексе III был разделен на два компонента (разд. 5.8). Редокс-потенциометрию используют и при исследовании Fe/S-белков. В этом случае редокс-состояние компонента определяют по сигналу ЭПР.

Потенциалы полувосстановления идентифицированных компонентов дыхательной цепи представлены на рис. 5.11. Указанные значения Ет определены для недышащих митохондрий. Для

Дыхательные цепи

113

того чтобы определить величину Еъ любого компонента в процессе дыхания, необходимо просто определить степень его восетановленности. Эти величины для дышащих митохондрий в состоянии 4 также показаны на рис. 5.11. Редокс-компоненты в цепи распадаются на четыре эквипотенциальные группы. Скачки потенциалов между ними соответствуют участкам, где происходит транслокация протонов. Выделяемая на этих участках энергия (падение ?ь электронов) запасается в форме протонного электрохимического потенциала.

5.4. ТРАНСЛОКАЦИЯ ПРОТОНОВ В ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ; СТРУКТУРНЫЕ ПРЕДСКАЗАНИЯ, ВЫТЕКАЮЩИЕ ИЗ МОДЕЛИ «ПЕТЕЛЬ» И МОДЕЛИ «КОНФОРМАЦИОННЫХ ПОМП»

(Обзоры: Greville, 1969; Mitchell, 1976b, 1979а; Papa, 1976; Wikstrom, Krab, 1979)

Альтернативные гипотезы о механизме транслокации протонов при работе дыхательной цепи были представлены на рис. 4.10 в связи с вопросом о стехиометрии Н+/2е~. Прямой механизм петель в дыхательной цепи, предложенный Митчеллом, включает ряд определенных экспериментально проверяемых предсказаний. Согласно модели петель, выброс протонов происходит в результате переноса электронов от переносчика Н-ато-мов (Н++е~) к чисто электронному переносчику, при котором протоны освобождаются на наружной поверхности мембраны. Далее электроны переносятся от чисто электронного переносчика к следующему переносчику Н-атомов, и это сопровождается захватом протонов из матрикса (рис. 4.10). Отсюда следует, что в цепи должна соблюдаться строгая стехиометрия 2Н+/2е_ на петлю (разд. 4.3), в линейной последовательности переносчиков должны правильно чередоваться переносчики двух типов, а их расположение в мембране должно соответствовать наблюдаемому направлению переноса протонов. Напротив, модель конфор-мационных помп значительно менее определенна и может быть использована для объяснения практически любых экспериментальных данных.

Основной проблемой в гипотезе петель является отсутствие доказательств существования достаточного числа переносчиков (H+-fe~) в дыхательной цепи. В цепи найдены лишь два явных переносчика (Н++е"): FMN в комплексе I (разд. 5.6) и UQm. Обнаружено также около 15 возможных переносчиков электронов (до 8 Fe/S-белков, 5 цитохромов и 2 атома Си). Одним из решений этой проблемы явилась гипотеза протондвижущего Q-цикла (разд. 5.8), в котором UQ]0 играет роль переносчика (Н++е~) сразу в двух петлях.

114 Глава 5

е~ (низкий ^ потенциал)

Т

в (высокий потенциал)

С Конформационное

изменение R РеЪокс-изменения

Р Изменение

протонированности

ООкисленный переносчик

ОВосстановленный переносчик

О Q

Н*-Свяэывающий центр с низким сродством

\\*-Связывающий центр с высоким срооством

Рис. 5.12. Модель РеДокс-зависимой =

Показана одна из гипотетических? моделей шчшх состояниях

рией Ш+/1е- Помпа может ^Хна°ии двух конформацни, двух редокс-

Иногда можно встретить утверждения, что гипотеза петель требует, чтобы петли полностью пересекали мембрану и соответствующие редокс-переносчики выходили на ее наружную поверхность. Однако для функционирования петли необходима лишь возможность выхода протонов на наружную сторону мембраны. Можно предполагать, что все редокс-переносчики расположены вблизи от внутренней поверхности мембраны и перенос протонов осуществляется с помощью специальных протонных каналов, аналогичных компоненту Fo АТР-синтетазы (разд. 7.3).

Хотя обычно принято противопоставлять две гипотезы о механизме транслока

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Скачать книгу "Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию" (1.67Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)