78 г. (Garland, 1978; Chappell, 1979).

1.2. ХЕМИОСМОТИЧЕСКАЯ ГИПОТЕЗА

(Обзоры: Mitchell, 1961, 1966, 1968, 1979а, Greville, 1969).

Центральный постулат хемиосмотической гипотезы гласит, что электронпереносящие цепи митохондрий, хлоропластов и бактерий сопряжены с системой синтеза АТР через разность

электрохимических потенциалов протонов (А|хн+) на сопрягающих мембранах. Электрохимический потенциал протонов слу-

Хемиосмотический принцип энергетического сопряжения

11

жит термодинамической мерой того, насколько градиент протонов через мембрану далек от равновесия (это будет обсуждаться далее, см. разд. 3.4). Перенос электронов и синтез АТР сопряжены с работой двух различных обратимых протонных помп. При переносе электронов образуется разность потенциалов

Арн+, которая затем используется для обращения протонной помпы, гидролизующей АТР (АТР-синтетазы), т. е. для синтеза АТР.

Таким образом, всякая сопрягающая мембрана содержит две протонные помпы. Движущей силой для одной из них служит перенос электронов или доглощение фотонов, а для другой—гидролиз АТР (рис. 1.1). Обе помпы ориентированы в мембране одинаково: .перенос электронов по цепи (от высокопотенциальных доноров к акцепторам) и гидролиз АТР АТР-синтетазой приводят к трансмембранному переносу протонов в одном направлении ( рис. 1.1). И в том и в другом случае перенос протонов через мембрану тесно связан с переносом электронов или гидролизом АТР.

На рис. 1.2 показано, как такие помпы могут быть использованы для непрерывного синтеза АТР. Если создать условия, в которых активна лишь АТР-синтетаза, и добавить к органел-лам АТР, та гидролиз АТР и перенос протонов будут происходить до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие между энергией, освобожденной а б при гидролизе АТР, и энергией, необходимой для переноса протонов против образовавшегося градиента их концентрации (рис. 1.2,Б). Если теперь нарушить равновесие, убрав из среды АТР, то произойдет обращение АТР-гидролазной реакции и начнется синтез АТР за счет энергии протонного градиента (рис. 1.2.В). Синтез АТР приведет в свою очередь к рассеиванию градиента; для его поддержания необходима работа второй помпы. Именно так все и происходит in vivo: АТР постоянно используется в различных реакциях в

АТР

АТР

Рис. 1.2. Протонное электрохимическое сопряжение. А. АТР гидролизуется, Дрн+ генерируется. Б. Равновесие. В. Др,н+ поддерживается извне, АТР синтезируется. Г. Величина Дрн+ поддерживается постоянной благодаря работе второй протонной помпы.

12 Глава 1

цитозоле, а высокий уровень Лц.н+ поддерживается за счет работы дыхательной или фотосинтетической электронпереносящей цени (рис. 1.2, Г).

В результате работы протонных помп устанавливается круговой ток протонов через сопрягающую мембрану (рис. 1.3).

А Б

Рис. 1.3. Аналогия между электрической цепью (А) и протонным циклом (Б). В обоих случаях имеются генераторы потенциала (батарея и дыхательная цепь), а также потенциал (разность электрических потенциалов и разность электрохимических потенциалов протонов), который измеряется в вольтах или милливольтах. И в том и в другом случае потенциал можно использовать для совершения работы (свет лампы и синтез АТР). Обе цепи могут быть замкнуты накоротко. Скорости химических реакций как в батарее, так и в дыхательной цепи тесно связаны с током электронов и протонов в остальной части цепи, а он в свою очередь зависит от сопротивления в этой части цепи. При увеличении тока потенциал в обеих цепях падает.

Этот ток весьма сходен с током в электрической цепи, причем такую аналогию можно продолжить даже при обсуждении деталей сложных энергетических процессов (гл. 4). Как и в случае электрической цепи, может быть определена разность потенциалов (уже введенная нами Ацн+), протонный ток (тн+) н протонная проводимость (СмН+), равная отношению тока, протекающего через данный компонент, к падению потенциала на нем. В последующих главах мы будем часто пользоваться этими параметрами.

Ясно, что для того, чтобы не произошло короткого замыкания, мембрана должна быть замкнутой и должна иметь высокое сопротивление для протонов. Одно из наиболее успешных предсказаний хемиосмотической гипотезы состоит в том, что многие агенты, разобщающие окисление и синтез АТР, действуют именно путем повышения протонной проводимости мембран и вызывают короткое замыкание (рис. 1.3). Для того чтобы в рамках хемиосмотической гипотезы объяснить перенос отрицательно заряженных метаболитов во внутреннее пространство митохондрии (также заряженное отрицательно), Митчелл предположил существование транспортных систем, .переносящих та-

Хемиосмотический принцип энергетического сопряжения

13

кие метаболиты в нейтральной форме в комплексе с протонами или в обмен на ионы ОН- (Mitchell, 1961, 1966).

Существует определенная семантическая трудность при выборе между выражениями «хемиосмотическая гипотеза» и «теория Митчелла». В этой книге термин «хемиосмос» используется как синоним приведенного выше основного постулата, согласно которому сопряжение осуществляется через протонный градиент. Существует множество вторичных гипотез, принадлежащих Питеру Митчеллу и другим исследователям, в которых рассматриваются детальные молекулярные механизмы работы протонных помп, однако следует подчеркнуть, что справедливость основного постулата не зависит от того, верны ли эти гипотезы.

1.3. СОПРЯГАЮЩИЕ ОРГАНЕЛЛЫ

1.3.1. МИТОХОНДРИИ И СУБМИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ ЧАСТИЦЫ

[Обзоры: Nedergaard, Cannon, 1979 (выделение); Munn, 1974 (морфология); Harmon et al., 1974; De Pierre, Ernster, 1977 (локализация ферментов)].

Схематическое изображение тонкого среза через митохондрию приведено на рис. 1.4. Митохондрии обычно имеют длину 0,7—1 мкм. Их форма непостоянна и в клетке может меняться. Форма крист в митохондриях, выделенных из различных тканей, также сильно различается, причем это относится даже к одним и тем же митохондриям, суспендированным в различных средах.

Рис. 1.4. Различные митохондриальные препараты. А. Интактная митохондрия. / — цикл лимонной кислоты. Б. Субмитохондриальная частица.

14 Глава 1

Наружная мембрана митохондрий содержит белки, которые образуют неспецифические поры, пропускающие вещества с молекулярной массой менее 10 000 (Zalman et al., 1980). Внутренняя мембрана является сопрягающей. Чем выше дыхательная активность ткани, из которой получены митохондрии, тем больше складок имеет внутренняя мембрана. На той стороне внутренней мембраны, которая обращена в матрикс (М-сторона), при негативном контрастировании фосфовольфраматом можно наблюдать грибовидные выросты, представляющие собой каталитические единицы АТР-синтетазных комплексов. Все ферменты цикла трикарбоновых кислот локализованы в матриксе, за исключением сукцинатдегидрогеназы, которая связана с М-стороной внутренней мембраны. Пулы NAD и NADP в матриксе и в цитозоле отделены друг от друга, в то время как АТР и ADP могут обмениваться между матриксом и цитозолем через обменный переносчик адениновых нуклеотидов, локализованный во внутренней мембране.

Митохондрии обычно выделяют путем мягкого разрушения ткани в изотоническом растворе сахарозы с последующим дифференциальным центрифугированием, которое позволяет отделить митохондрии от ядер, обломков клеток и микросом (фрагментов эндоплазматического ретикулума). Этот метод пригоден лишь для нежных тканей, таких, как печень. В случае более плотных тканей, таких, как сердечная мышца, их вначале обрабатывают протеазами (типа нагаре, например) или разрушают в гомогенизаторе. Митохондрии из дрожжей выделяют после переваривания клеточной стенки с помощью пищеварительных ферментов улитки.

При разрушении митохондрий ультразвуком образуются вывернутые субмитохондриальные частицы (СМЧ) (рис. 1.4), которые называют также электронтранспортными частицами (ЭТЧ). Эти частицы имеют центры связывания субстратов дыхательной цепи и АТР-синтетазы на внешней поверхности й потому широко используются в экспериментах (Lee, 1979).

1.3.2. ДЫШАЩИЕ БАКТЕРИИ И МЕМБРАННЫЕ ПРЕПАРАТЫ ИЗ НИХ

(Обзоры: Kaback, 1974; Konings, 1979)

Некоторые вопросы, связанные с биоэнергетикой бактерий, могут быть исследованы в интактных клетках. В то же время у многих бактерий, прежде всего грамотрицательных, клеточная стенка образует барьер, плохо проницаемый для различных веществ. По этой причине в экспериментах часто используют сфе-ропласты — клетки, лишенные стенки с помощью лизоцима (рис. 1.5). В сферопластах сохраняется все клеточное содержи-

Хемиосмотический принцип энергетического сопряжения

15

мое и правильная ориентация мембраны, но они становятся осмотически чувствительными.

При продавливании клеток под высоким давлением через очень узкое отверстие в прессе Френча можно получить вывернутые мембранные везикулы, аналогичные субмито-хондриальным частицам. Если же сферопласты подвергнуть гипотоническому лизису, то образуются пустые пузырьки («тени»), сохраняющие исходную ориентацию мембраны; их иногда называют «кабако-сомы».

1.3.3. ХЛОРОПЛАСТЫ

(Обзор: Park, Sane, 1971)

Хлоропласты — это один из шащих бактерий, типов пластид — мембранных

пузырьков, встречающихся в клетках зеленых водорослей и высших растений. В этих клетках может насчитываться от одного до сотен хлоропластов. Хлоропласты в среднем значительно крупнее, чем митохондрии: их диаметр составляет 4—10 мкм, а толщина— 1 — 2 мкм (рис. 1.6). Хлоропласт заключен в оболочку из двух близко прилежащих друг к другу мембран. Матрикс, находящийся под внутренней мембраной, называется стромой. В строме расположены мембранные везикулы, которые называют тилакоидами. Несколько тилакоидов, собранных в стопку, образуют грану. Мембрана тилакоидов содержит пигменты фотосинтеза и фотосинтетическую цепь переноса электронов. Эта мембрана является сопрягающей: освещение приводит к переносу протонов внутрь тилакоида. АТР-синтетаза хлоропластов локализована в мембране тилакоидов и ориентирована так, что грибовидные выросты обращены в строму. АТР и NADPH, образующиеся при фотофосфорилировании