Биологический каталог




Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию

Автор Д.Д.Николс

итохро-мов в видимой области. Абсолютные спектры восстановленной и окисленной форм цитохрома с (Л) и (Б) получены на очищенном препарате с помощью двухлучевого спектрофотометра, в котором кювета сравнения содержала воду. В. Дифференциальный спектр цитохрома с (восстановленная минус окисленная формы очищенного цитохрома с). Кювета измерения содержала восстановленный цитохром с, а кювета сравнения — окисленный цитохром с. Г. Дифференциальный спектр субмитохондриальных частиц из сердца быка, снятый при комнатной температуре (разность спектров СМЧ в восстановленном и окисленном состоянии. В кювету с образцом СМЧ был добавлен дитионит, а в кювету сравнения — феррицианид. Д. Тот же спектр, что и в Г, но записанный при температуре жидкого азота (77 К). Обратите внимание, что а-полосы стали более узкими. (С любезного разрешения Ingledew.)

400 450 550 600 650 X, нм

циальный спектр субмитохондриальных частиц, где пики всех цитохромов накладываются друг на друга.

Разные цитохромы легче всего различить по а-полосе поглощения в районе 550—610 нм. Ширина спектральных полос может быть значительно уменьшена, если спектры снимать при температуре жидкого азота (77К). В этих условиях уменьшается уширение полос за счет теплового движения молекул, а световой путь увеличивается благодаря многократному внутреннему отражению на кристаллах льда (рис. 5.5).

Дифференциальная спектроскопия при комнатной температуре позволяет различить лишь один вид цитохромов а, Ь и с. Однако в действительности каждый из них состоит из двух спектрально различных компонентов. Цитохромы типа а можно разделить

Дыхательные цепи

105

на а и аз в присутствии СО, который специфически взаимодействует с аз. Неясно, однако, являются ли цитохромы а и аз химически различными веществами. Цитохромы типа b состоят из двух компонентов, которые по-разному отвечают

на образование Др,н+ на мембране (разд. 5.8). Эти цитохромы обозначают 6т (или &5вг) и Ьк (или Ь56б). В последнее время получены доказательства (разд. 5.8) того, что эти цитохромы химически идентичны, но работают в дыхательной цепи в виде димера.

Два цитохрома типа с (цитохромы с и Ci) можно спектрально различить при низких температурах. Цитохром С\ — это интегральный белок комплекса III (разд. 5.8), а цитохром с — периферический белок, расположенный на Ц-стороне мембраны и связывающий комплекс III с цитохром с-оксидазой.

В отличие от цитохромов другой большой класс электронных переносчиков — железосерные (Fe/S) белки (рис. 5.6) имеют слабо выраженные спектры в видимой области, но зато им присущи характерные спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭПР; Beinert, 1978; рис. 5.7). Сигнал ЭПР дает неспа-ренный электрон, который может присутствовать как в восстановленной, так и в окисленной формах различных Fe/S-белков. Каждую Fe/S-группу, которую можно обнаружить по ЭПР-сиг-налу, называют центром или кластером. Один полипептид может содержать несколько таких центров. Пока неясно, сколько Fe/S-центров содержится в дыхательной цепи; в один лишь комплекс I может входить до 7 центров (разд. 5.6).

Атомы железа в Fe/S-белках ковалентно связаны с апобел-ком через серу цистеиновых остатков и с другими атомами железа через кислотолабильные серные мостики (рис. 5.6). Fe/S-Центры могут содержать 2 или 4 атома железа, но каждый центр является одноэлектронным переносчиком. Fe/S-Белки широко распространены в различных электронтранспортных цепях и могут иметь самые различные значения Ет,7 — от—430 мВ для ферредоксина в хлоропластах (разд. 6.4) до +360 мВ для бактериального HiPIP («высокопотенциального железосерного белка») (разд. 6.3).

Убихинон (коэнзим Q, CoQ, UQ или просто Q) в митохонд-

Рис. 5.6. Железосерные центры. Показан центр, содержащий 4 атома железа и 4 атома кислотолабильной серы. При обработке кислотой эти атомы серы (подчеркнуты) освобождаются в виде H2S. Хотя центр содержит 4 атома Fe, он может претерпевать лишь одноэлектронный ре-докс-переход.

106 Глава 5

Источник микроволн

Магнит

Катушки развертки

Усилитель Самописек

Образец

Осциллятор

В

Рис. 5.7. Электронный парамагнитный резонанс и определение Fe/S-центров. А. Схема прибора. Микроволновой генератор создает монохроматическое излучение с частотой ~109 Гц (Я,=30 см). Неспаренные электроны в образце поглощают это излучение, если приложено внешнее магнитное поле. Точная величина поля, необходимого для поглощения, зависит от молекулярного окружения электрона и определяется формулой

где h —постоянная Планка, у— частота излучения, р" — константа (магнетон Бора), Н — напряженность приложенного магнитного поля, a g — спектроскопическая константа, которая зависит от природы образца. Спектры получают, варьируя магнитное поле при постоянной частоте микроволнового излучения (Б). На практике используют дифференциальные спектры (В), которые получают благодаря наложению на постоянно возрастающее поле очень быстрых модуляций небольшой амплитуды, получаемых за счет ауксилярных катушек развертки. Изменение поглощения микроволн при каждом таком колебании позволяет получить первую производную спектра. Спектры сопрягающих мембран очень сложны (Г), и ^-факторы различных компонентов можно определять по положению пиков, минимумов или точек перегиба. В образцах должна быть высокая концентрация белка (10—50 мг белка-мл-1). и °ни должны находиться в замороженном состоянии.

риях животных представлен в форме UQio, т. е. его молекула содержит цепь из 10 пятиуглеродных изопреновых мономеров (рис. 5.8). Эта содержащая 50 атомов углерода цепь определяет высокую гидрофобность UQio. Присоединяя 2Н+ и 2е~, UQ вос-

Дыхательные цепи

107

станавливается и превращается в UQH2 (убихинол). С помощью метода ЭПР было установлено также существование частично восстановленной свободнорадикальной формы-—UQH (убисеми-хинон). Роль UQ в работе дыхательной цепи долгое время оставалась неясной. Удельная скорость превращения UQ значительно ниже, чем для других компонентов цепи. Это послужило основой для предположения о том, что хиноны лежат вне основного пути переноса электронов. Однако оказалось, что UQ присутствует в мембране в значительно больших количествах, чем остальные компоненты цепи, и суммарная скорость работы пула UQ вполне достаточна, чтобы обеспечить перенос электронов по основному пути (Kroger, KHngenberg, 1973). Простейшее предположение о роли UQ состоит в том что он работает как подвижный редокс-переносчик, соединяя комплексы I и II с комплексом III. В гипотезе «Q-цикла» предполагается также, что UQ играет центральную роль в переносе электронов внутри ком-

Окисленная Восстановленная форма форма A. SduxuHOHn

О ОН

о он

Б. Менахинон

о он

R—(СН2-СН = С-СНг)„Н

Рис. 5.8. Убихинон и сходные с ним редокс-переносчики.

108 Глава 5

плекса III (разд. 5.8). Хотя UQm является природным медиатором, его высокая гидрофобность затрудняет использование этого соединения в экспериментальной работе. Обычно в опытах используют убихиноны с более короткой боковой цепью, которые лучше растворяются в воде.

В некоторых анаэробных электронтранспортных цепях роль UQ играет менахинон (разд. 5.12). В хлоропластах аналогичным редокс-переносчиком (разд. 6.4) служит пластохинон (рис. 5.8).

5.3. ЛИНЕЙНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ РЕДОКС-ПЕРЕНОСЧИКОВ В ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ

Последовательность электронных переносчиков в дыхательной цепи митохондрий (рис. 5.1) в основном была выяснена к началу 60-х годов с помощью полярографии (разд. 4.5) и спектроскопических методов. Эти исследования были значительно облегчены тем, что существует возможность подавать электроны в цепь и акцептировать их в ряде точек вдоль цепи, которые соответствуют связующим участкам между дыхательными комплексами. Так, NADH восстанавливает комплекс I, сукцинат — комплекс II и тетраметил-п-фенилендиамин (TMPD)—цитохро-моксидазу (рис. 4.2). Вместе с TMPD обычно добавляют аскор-бат, который поддерживает медиатор в восстановленной форме. Феррицианид является неспецифическим и непроникающим акцептором электронов. Он может быть использован не только для изучения отдельных участков цепи, но и для определения ориентации некоторых компонентов в мембране (KHngenberg, 1979).

Открытие специфических ингибиторов переноса электронов позволило использовать кислородный электрод для определения относительного расположения точек входа электронов в цепь и действия ингибиторов (рис. 5.9). Далее с помощью спектрального анализа можно было определить положение всех редокс-переносчиков относительно этих точек.

Новые возможности для выяснения порядка расположения редокс-компонентов появились благодаря развитию техники, позволившей исследовать кинетику окисления дыхательной цепи после добавления кислорода к анаэробной суспензии митохондрий (рис. 5.4). Последовательность окисления компонентов отражала порядок их расположения по отношению к терминальной оксидазе. Этот подход позволил также определить, способен ли кинетически данный компонент обеспечить перенос электро-, нов по основному пути. Высокие скорости окисления в этих условиях потребовали использования техники остановленной струи (стоп-флоу) (рис. 5.4) для быстрого запуска реакции.

Переносчики в дыхательной цепи должны располагаться в такой последовательности, чтобы их редокс-потенциалы ?h постепенно возрастали от NADH до 02. Величина ?ь определяется

Дыхательные цепи

109

А. Запись С^-электрода Митохондрии

Аноксия

?. Об&яснение

В-Гидроксибутират Сукцинат ТЬЛРЪ/аскорбат

¦ „1-1

nad+-|f-*—1|_-i-jf-^q,

Ротенан Антимицин A CN

Рис. 5.9. Типичный эксперимент по измерению скорости дыхания с помощью кислородного электрода, который позволяет определить относительное расположение мест действия ингибиторов и точек подачи электронов в дыхательной цепи. Митохондрии печени инкубировали в среде, насыщенной воздухом и содержащей FCCP [протонофор, позволяющий создать условия, при которых протонная проводимость митохондрий не является фактором, лимитирующим скорость (разд. 2.5.3)]. Исходно в среде присутствует КтАО+-зависймый с

страница 19
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Скачать книгу "Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию" (1.67Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.07.2017)