Биологический каталог




Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию

Автор Д.Д.Николс

искусственно

созданный Ар.н+ способен обеспечить синтез АТР в любой сопрягающей мембране, содержащей активную АТР-синтетазу. Впервые этот процесс был продемонстрирован на хлоропластах,

Рис. 4.19. Эксперимент с «кислотной ванной», который доказал, что АТР может синтезироваться за счет ДрН (Jagendorf, Uribe, 1966). Хлоропласты с разрушенной оболочкой (разд. 1.3) инкубировали в темноте при рН 4 в среде, содержащей сукцинат. Были добавлены ингибиторы, блокирующие перенос электронов. Сукцинат медленно проникал внутрь тилакоидов и освобождал там протоны, так что рН внутри тилакоидов опускался примерно до 4 (слева). Затем внешний рН быстро поднимали до 8, создавая на мембране ДрН около четырех единиц, и одновременно добавляли ADP, Pi и Mg2+ (справа). Выход протонов через АТР-синтетазу приводил к синтезу до 100 молей АТР на моль синтетазы. Искусственные протонофоры, такие, как FCCP, ингибировали образование АТР.

98 Глава 4

когда Ягендорф и Юрайб (Jagendorf, Uribe, 1966) показали, что хлоропласты, предынкубированные в темноте при кислом рН, способны синтезировать АТР в ответ на быстрое повышение рН с 4 до 8, при котором создается на мембране временный градиент рН в 4 единицы (рис. 4.19).

Хлоропласты обычно функционируют при высоком значении ДрН и низком Дф на мембране. В случае митохондрий наблюдается обратная картина, и первые успешные опыты по синтезу

АТР на искусственном Дцн+ были поставлены в условиях, когда на мембране субмитохондриальных частиц создавали и ДрН, и диффузионный потенциал К+ (Thayer, Hinkle, 1975).

Эксперименты с интактными органеллами показали, что

Дц.н+ может служить единственным источником энергии для синтеза АТР. Они, однако, не позволяют отличить модели энергетического сопряжения, в которых Дцн+ является единственным фактором, обеспечивающим связь между дыханием и синтезом АТР, от моделей, в которых протонные помпы являются побочными системами, находящимися в равновесии с альтернативным высокоэнергетическим интермедиатом (рис. 1.11). Для этого необходимо было очистить АТР-синтетазу от всех компонентов, общих с дыхательной цепью, встроить ее в искусственную мембрану (разд. 1.3) и создать на ней искусственный Дц.н+- Все это было сделано с высокоочищенной АТР-синтетазой из термофильной бактерии (Sone et al., 1977).

Глава 5

дыхательные цепи 5.1. ВВЕДЕНИЕ

Дыхательная цепь митохондрий состоит из более чем 20 различных переносчиков электронов и множества (неопределенное количество) «структурных» белков (рис. 5.1). Общепризнано, что дыхательная цепь функционирует как окислительно-восстановительная протонная помпа. В то же время структурная основа механизма ее работы выяснена лишь частично. В этой главе мы рассмотрим подходы, которые применяются при исследовании структуры дыхательных цепей митохондрий и бактерий.

Сцкаинат [FAD + 2Fe/S-ljeHmpbj] Злектронпереносящии 0 v / флавопротеин

(В ч /

NADH [FMN +5Fe/S-neHmp(p;]—»-UQ -*— а-Глицерофосфат

\

Щит. Ь, Te/S, Цит.с{] (Ш)

Аснорбат -»-TMPD-»~Цит.с

Щит.а, а3 + 2Си] (1У,или цитохром | с-оксидаза)

02

Рис. 5.1. Линейная последовательность редокс-переносчиков в дыхательной цепи митохондрий. Группы редокс-переносчиков, заключенные в скобки, образуют структурные комплексы от I до IV.

5.2. КОМПОНЕНТЫ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ И МЕТОДЫ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

(Обзор: Slater, 1974)

Суммарная разность редокс-потенциалов при переносе электрона по всей цепи составляет 1,1 В — это разность между ре-докс-парами NAD-t/NADH и 02/2Н20. Большая часть дыхательной цепи обратима (разд. 4.7), и для того, чтобы происходил прямой или обратный перенос электронов, необходимо, чтобы как окисленные, так и восстановленные формы компонентов присутствовали в сопоставимых концентрациях. Другими словами, действующий редокс-потенциал пары Еь (разд. 3.3) не должен сильно отклоняться от ее потенциала полувосстановления Ет- Как будет показано на рис. 5.11, это требование выполняется на всех участках цепи, что может быть использовано для определения порядка расположения переносчиков.

Дыхательные цепи

101

На начальной стадии — переносе электронов от растворимых дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот к цепи — необходимо присутствие кофактора, который имел бы потенциал полувосстановления в районе — 300 мВ и мог работать как подвижный переносчик электронов между дегидрогеназами матрикса и мембранными компонентами цепи. Эти функции выполняет пара NADH/NAD+, которая имеет ?т.7 = —320 мВ (рис. 5.2).

Хотя большая часть электронов попадает в дыхательную цепь этим путем, существует также группа дегидрогеназ, которые работают при потенциалах полувосстановления субстратных пар, близких к 0 мВ. Эти ферменты — сукцинатдегидрогеназа, а-глицерофосфат — дегидрогенаэа и «электронпереносящий флавопротеин» (переносящий электроны от жирных кислот при р-окислении) — поставляют электроны прямо в цепь при потенциале около 0 мВ без посредства пары NAD+/NADH (рис. 5.1). Такой прямой перенос требует, чтобы эти ферменты находились в непосредственном контакте с дыхательной цепью или, другими словами, были бы связанными с мембраной.

В дыхательную цепь входят следующие редокс-переносчики: флавопротеины, содержащие прочносвязанный FAD или FMN в качестве простетической группы (рис. 5.3) и осуществляющие перенос (2Н+ + 2е~); цитохромы, имеющие порфириновые про-

Окисленный Восстановленный

Рис. 5.2. Никотинамидадениндинуклеотид (NAD+; никотииамид —рибоза— Р — О — Р — рибоза — аденин).

'Окисленная форма Восстановленная форма

Рис. 5.3. 7,8-Диметилизоаллоксазин, входящий в состав флавинмононуклеоти-да (FMN; 7,8-диметилизоаллоксазин-0-рибитол-Р) и флавинадениндинуклео-THfla(FAD; 7,8-диметилизоаллоксазин-0-рибитол-Р — О —Р— рибоза — аденин).

102 Глава 5

Источник света

Монохроматор

Прерыватель

Кювета с образцом и кювета сравнения

Фотоумножитель / самописЩ"

HI

Монохроматор

Фотоумножитель

самописец,

Монохроматор 2

Рис. 5.4. Спектрофотометрическая техника для исследований дыхательной цепи. А. Двухлучевой спектрофотометр, в котором луч света от единственного монохроматора направляется попеременно (с помощью прерывателя, осциллирующего с частотой около 300 Гц) на кювету с образцом и кювету сравнения. Используется один большой фотоумножитель. Переменный сигнал усиливается и преобразуется таким образом, что на выходе усилителя он пропорционален разности в поглощении между двумя кюветами. Если постепенно изменять длину волны монохроматора, то можно получить дифференциальный спектр: (образец) — (контроль). Этот спектрофотометр используется для записи дифференциальных спектров, которые не меняютси во времени. Б. Двухволновой спектрофотометр, где используются два монохроматора: один устанавливается на длину волны, которая оптимальна для наблюдаемых изменений, а второй — вблизи изобестической точки, где изменений не происходит. Свет от двух монохроматоров проходит попеременно через одну и ту же кювету. Усилитель преобразует затем сигнал с фотоумножителя таким образом, что на самописце записывается разность экстинкций при двух длинах волн (ki—Я2) в зависимости от времени реакции. Двухволновой режим работы используется для изучения кинетики изменений в спектре дан-

Дыхательные цепи

103

стетические группы ц работающие как одноэлектронные переносчики; железосерньНе (или негемовые железосодержащие) белки, содержащие простетические группы и также способные к одноэлектронному переносу; убихинон, который является подвижным жирорастворимым кофактором, переносящим (2Н++ 2е~); наконец, связанная с белком медь, которая может восстанавливаться из Cu (II) в Си (I).

Цитохромы классифицируют по структуре их порфириновых простетических групп. В митохондриях содержатся цитохромы типов а, Ь и с. В некоторых бактериях в качестве терминальных оксидаз присутствуют цитохромы d и о. Цитохромы о — это аутооксидабельные цитохромы типа Ъ, а цитохромы d содержат вместо порфирина частично насыщенное хлориновое кольцо.

Цитохромы были обнаружены первыми среди компонентов дыхательной цепи благодаря их различным спектрам поглощения в видимой области. Индивидуальные цитохромы имеют одну полосу поглощения в окисленной форме и, как правило, три полосы поглощения в восстановленной форме. Однако измерение абсолютных спектров при исследовании цитохромов в интактных митохондриях сопряжено с большими трудностями, которые обусловлены неспецифическим поглощением и светорассеянием органелл. К тому же эти параметры могут меняться при изменении объема матрикса за счет метаболических процессов (разд. 2.7). В связи с этим спектры цитохромов обычно определяют с помощью чувствительной дифференциальной, или двухлучевой, спектроскопии, когда луч света с постепенно возрастающей длиной волны делится между двумя кюветами, где находятся митохондрии. Условия в кюветах должны быть идентичными, за исключением того, что в одну из них добавляют компонент, изменяющий степень восстановленности исследуемых цитохромов (рис. 5.4). Сигнал от кюветы сравнения затем автоматически вычитается из сигнала от кюветы с образцом, что позволяет исключить эффекты неспецифического поглощения. На рис. 5.5 показаны спектры восстановленного и окисленного выделенного цитохрома с, их дифференциальный спектр (восстановленный минус окисленный), а также аналогичныйдифферен-

ного компонента. В. Во многих случаях ручное перемешивание оказывается слишком медленным по сравнению с изучаемыми кинетическими изменениями. Для быстрых измерений двухволновой спектрофотометр может быть модифицирован. Суспензию митохондрий и реакционную среду помещают в два шприца и затем быстро вводят через специальный смеситель в кювету. Весь процесс занимает несколько миллисекунд. Если реагенты поступают в систему непрерывно с постоянной скоростью, то «возраст» смеси до измерения остается постоянным и зависит от длины трубок, соединяющих смеситель с кюветой (метод «непрерывной струи»). В методе «остановленной струи» после смешивания реагентов ведут наблюдения за «старением» смеси.

104 Глава 5

5

В

Д

Рис. 5.5. Спектры поглощения ц

страница 18
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Скачать книгу "Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию" (1.67Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.09.2017)