Биологический каталог




Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию

Автор Д.Д.Николс

естно, что обычные препараты митохондрий из печени, окисляющие сукцинат в состоянии 4 (табл. 4.1), имеют скорость дыхания 15 нмолей/ОХ

X мин-1-иг белка-1 и поддерживают Дцн+ 220 мВ. Прн добавлении протонофора FCCP в небольшой концентрации, скорость дыхания повышается до 100 нмолей О-мин-1-иг белка-1 и Ацн+ понижается до 40 мВ. Если принять, что соотношение Н+/0 для сукцината равно 6, то можно рассчитать величину дыхательного контроля, протонный ток и эффективную протонную проводимость до и после добавления FCCP.

. _ Дыхание после добавления FCCP

а) Величина дыхательного контроля =------ =

Дыхание до добавления FCCP

= 100/15 = 6,7

б) Протонный ток = Дыхание Н+/0 = 90 (—FCCP) = 600 (+FCCP) (единицы: н моль Н+ • мин-1 • мг белка-1)

(единицы

^ ,TJ. Пр я проводимость См Н+ = —-

Д,

:cf

(единицы: нмоль Н+• мин-1 ¦ мг белка-1 ¦ мВ-1

Протонная проводимость См Н+ = Протонный ток =90/220=

н+

0,41 (— FCCP) = 600/40 = 15 (+ FCCP)

Хемиосмотический протонный цикл

93

общие нехемиосмотические параметры энергизации могут быть сведены к величине СмН+. Действительно, эффективность энергетического сопряжения будет тем выше, чем ниже СмН+. Существует, однако, один тип митохондрий, для которых повышение протонной проводимости внутренней мембраны имеет физиологический смысл. Это митохондрии из ткани бурого жира, имеющие очень высокую скорость дыхания, которая необходима как для термогенеза, так и для уничтожения избытка субстратов в случае регуляции количества жировых запасов. В этой ткани нормальный контроль дыхания уровнем синтеза АТР нарушен, так как во внутренней мембране находится белок, работающий как регулируемый протонный переносчик. Он обеспечивает вход протонов в митохондрии и переход дыхания в состояние 3 без стехиометрического синтеза АТР (Nicholls, 1976, 1979) и в 30 раз по сравнению с митохондриями других типов повышает величину СмН+.

4.6. НЕХЕМИОСМОТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО СОПРЯЖЕНИЯ

4.6.1. ДЫХАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ

Дыхательный контроль — это параметр, введенный еще до появления хемиосмотической теории, который позволяет оценить интактность митохондриального препарата. Он определяется как отношение скорости дыхания при максимальном синтезе АТР (т. е. в присутствии ADP )или в присутствии протонофора к скорости дыхания в отсутствие синтеза АТР или протонофора, т. е.

т, „ Дыхание в состоянии 3

Дыхательный контроль = —-. (4.4)

Дыхание в состоянии 4

Обычно его величина варьирует от 3 до 15 в разных препаратах. Хотя этот параметр можно использовать на практике, необходимо помнить, что он является смешанной функцией: уровень дыхания в состоянии 4 определяется протонной проводимостью (СмН+) мембраны, а скорость дыхания в состоянии 3 лимитируется различными процессами: транспортом субстратов, активностью дегидрогеназ, дыхательной цепью, синтезом АТР или переносом адениновых нуклеотидов. Поэтому к интерпретации величин дыхательного контроля следует подходить с осторожностью. Собственно уровень дыхания в состоянии 4 может служить иногда лучшим критерием степени сопряженности дыхания и синтеза АТР, чем дыхательный контроль.

94 Глава 4

4.6.2. СООТНОШЕНИЯ ADP/O И Р/О

Стехиометрические соотношения переноса протонов в дыхательной цепи и при синтезе АТР — это вполне определенные величины, даже если их истинные значения остаются предметом дискуссий. В то же время общая стехиометрия синтеза АТР по отношению к уровню дыхания может варьировать от теоретического максимума (около одной молекулы АТР на 2е~, перенесенных через пункт сопряжения) до нуля в зависимости от величины протонной утечки, идущей в обход АТР-синтетазы (рис. 4.1). Всякое воздействие, повышающее проводимость мембраны, будет понижать долю протонов, переносимых с помощью АТР-синтетазы. При повышении СмН+ снижается величина

Др,н+ (рис. 4.17), так что термодинамическая способность к синтезу АТР также уменьшается. Поскольку определить ток утечки в условиях синтеза АТР очень трудно, при расчетах величин ADP/O и Р/О путем экстраполяции к нулевой протонной утечке возможны большие ошибки.

4.6.2.1. Определение ADP/O с помощью кислородного электрода

Этим методом определяют начальную величину ускорения дыхания в состоянии 3 после добавления определенного небольшого количества ADP к митохондриям, дышащим в состоянии 4 (рис. 4.15). Практически весь добавленный ADP фосфорилирует-ся при этом до АТР, так что соотношение АТР : ADP обычно достигает 100: 1 после восстановления состояния 4, и можно рассчитать отношение числа молей добавленного ADP к числу молей использованного кислорода. Для того чтобы скорректировать данные с учетом утечки протонов, принято считать, что она прекращается при переходе в состояние 3. На первый взгляд может показаться, что если после включения фосфорилирования

Др-н-ь снижается лишь на 30% (рис. 4.16), то и величина утечки не должна заметно меняться. В действительности, однако, протонная проводимость мембраны падает практически до нуля,

если Дцн+ опускается ниже 200 мВ, так что при расчетах сте-хиометрических соотношений правильнее полностью учитывать поглощенный при фосфорилировании кислород.

4.6.2.2. Определение Р/О с помощью гексокиназной ловушки АТР

Следующий метод состоит в измерении синтеза [-у-32Р]-АТР из ADP и 32Pi в присутствии гексокиназы, в результате действия которой фиксируется метка и регенерируется ADP: АОР + з2р._^ [7-wp].ATP,

Хемиосмотический протонный цикл

95

[т-32Р] - АТР + Глюкоза -»¦ Глюкозо-6-32Р + ADP.

В этом методе дыхание измеряют кислородным электродом, затем реакцию останавливают и определяют глюкозо-6-32Р после его отделения от 32Рь Снижения скорости дыхания после стимуляции не наблюдается, так как ADP в этих условиях не исчерпывается. В отличие от того, что мы имеем при измерении с помощью кислородного электрода, в этих условиях гексокиназа поддерживает AGp на постоянном очень низком уровне. Это позволяет измерять синтез АТР даже при относительно неблагоприятных условиях.

Значения ADP/2e~, как и в случае со многими другими сте-хиометрическими соотношениями, остаются источником дискуссий. «Классическая» величина 1 АТР/2е_ на протонперенося-щий комплекс согласуется со стехиометрией Н+/0 6 и 4 для участков цепи NADH—02 и сукцинат — 02 соответственно лишь в том случае, если для синтеза АТР и переноса через мембрану адениновых нуклеотидов и Pi достаточно двух протонов. Существуют, однако, строгие доказательства того, что для транспорта субстратов фосфорилирования требуется перенос третьего протона (разд. 7.6). Более высокие величины Н+/0, равные 9 и 6 (рис. 4.10), для NADH и сукцината согласуются с соотношением Н+/АТР—3, включая транспорт. Бранд и др. (Brand et al., 1978) получили дробные значения величин ADP/2e~ для участков от сукцината до цитохрома с и от цитохрома с до 02, равные 0,67 и 1,33 соответственно.

4.7. ОБРАТНЫЙ ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ И ПРОТОННЫЙ ЦИКЛ ПРИ ГИДРОЛИЗЕ АТР

АТР-синтетаза способна работать обратимо, и постоянный синтез АТР поддерживается лишь благодаря постоянному поддержанию уровня Дцн+ и использованию АТР клеткой. Если дыхательная цепь ингибирована и к митохондриям добавлен АТР,

то АТР-синтетаза работает как АТРаза и генерирует Дцн+ примерно той же величины, что и работающая дыхательная цепь (рис. 4.7). Протонный цикл при этом может быть замкнут, если существует вход протонов в матрикс. Действительно, протоно-форы повышают скорость гидролиза АТР также, как и скорость дыхания; возникает так называемая «стимулированная разобщителем АТРазная активность». Классический подход, позволяющий различить, чем поддерживается энергозависимый процесс

в митохондриях: непосредственно Дцн+ или посредством АТР, состоит в определении чувствительности процесса к ингибитору

АТР-синтетазы олигомицину (разд. 1.4). Зависимый от Дцн+ процесс должен быть нечувствителен к олигомицину, если потен-

96 Глава 4

Антимицин А Опигомицин _/ _/

NADH

ADP+Pi

Рис. 4.18. Обратный перенос электронов по дыхательной цепи митохондрий. Схематически показаны ответы полученных обработкой ультразвуком суб-митохондриальных частиц в присутствии NAD+. А. Восстановление NAD+ (измеряемое при 340 нМ) вызвано обратным переносом электронов в комп.-лексе I. Сукцинат действует одновременно и как донор электронов для обратного переноса, и как субстрат для комплексов III и IV. Б. Сукцинат служит лишь донором электронов для восстановления NAD+, а Ацв + генерируется при гидролизе АТР. Комплекс III блокирован антимицином А.

циал создается дыхательной цепью, но он должен блокироваться им, если А|1н+ генерируется за счет гидролиза АТР. В случае АТР-зависимого процесса должна наблюдаться обратная ситуация (рис. 4.18).

В состоянии 4 величины Аин+ и разности редокс-потенциалов в комплексах I и III (рис. 4.2) близки к равновесию. Таким образом можно создать условия, когда в этих участках цепи будут происходить обратные реакции за счет обратного тока протонов. Необходимо отметить, что эти соображения неприменимы к ком-

Хемиосмотический протонный цикл

97

плексу IV, который работает практически необратимо. Обрат-

ный перенос электронов можно вызвать, либо генерируя Aiih+ при гидролизе АТР, либо используя перенос электронов от сук-цината или цитохрома с на 02. В последнем случае можно наблюдать либо перенос электронов в комплексе I, либо в комплексах I и III соответственно (рис. 4.18).

В физиологических условиях митохондриальная АТР-синте-таза не работает как протонпереносящая АТРаза, возможно, за исключением периодов аноксии, когда необходимо использовать

гликолитический АТР для поддержания Ацн+. Однако некоторые бактерии, такие, как Streptococcus jaecalis, при росте на глюкозе не имеют работающей дыхательной цепи и нуждаются в гидролизе гликолитического АТР для поддержания Дц.н+ на мембране, необходимого для транспорта метаболитов (Harold, 1977).

4.8. СИНТЕЗ АТР В УСЛОВИЯХ ИСКУССТВЕННОГО ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ГРАДИЕНТА ПРОТОНОВ

(Обзоры: Jagendorf, 1975; Mitchell, 1976 b; Kagawa, 1978; Fillingame, 1980)

Хемиосмотическая гипотеза предсказывает, что

страница 17
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Скачать книгу "Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию" (1.67Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(30.05.2017)