Биологический каталог




Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию

Автор Д.Д.Николс

но электрода сравнения Ag/AgCl, то ток, текущий в Цепи, будет пропорционален скорости превращения Ог на электроде. При определенных условиях этот ток пропорционален концентрации 02 в растворе. Тонкая проницаемая для 02 мембрана предохраняет электрод от отравления. Поскольку на электроде происходит превращение кислорода, среда должна непрерывно перемешиваться, чтобы на электродной мембране не образовывался слой, лишенный 02. Ячейка должна быть герметична; она име-¦ет лишь небольшое отверстие для внесения добавок. Электрод калибруют с помощью среды, насыщенной воздухом, а первоначального исчерпания кислорода достигают с помощью добавок дитионита. Обычно ячейка имеет объем 2 мл, и для опыта требуется 2—3 мг белка митохондрий.

88 Глава 4

ADP

а. Сукцинат Митохондрии

Бутилмалонат

Среда + FCCP

Ь. Сикцинат Митохондрии

Малонат

Среда+ FCCP

с. Сукцинат Митохондрии

\

CN" i_

СреЭо + fccp

rf Сцщинат Митохондрии I_? ADP

Срес)а

V

е. Сукцинат Митохондрии |__4 ADP

? Сукцинат

Митохондрии _\ FCCP

Олигомицин

Среда

Среда

Рис. 4.14. Использование кислородного электрода для изучения процессов превращения энергии в митохондриях. На схеме показаны шесть различных способов воздействия на пути превращения энергии в митохондриях. Схематические кривые показаний кислородного электрода иллюстрируют, как с его помощью можно изучать эти воздействия. Среда инкубации должна иметь соответствующую осмолярность, буферную емкость и содержать Р,. а — инги-бирование транспорта субстрата; Ь — ингибирование дегидрогеназы субстрата; с — ингибирование дыхательной цепи; d — ингибирование транслоказы ад'ениновых нуклеотидов; е — ингибирование АТР-синтетазы; f — добавка про-тонофора.

а) транспорт субстратов через мембрану;

б) активность дегидрогеназы данного субстрата;

в) активность дыхательной цепи;

г) транспорт адениновых нуклеотидов через мембрану;

д) АТР-синтетазная активность;

Хемиосмотический протонный цикл

89

Рис. 4.15. Определение соотношения ADP/О с помощью кислородного электрода. В представленном эксперименте митохондрии из печени крысы инкубировали в присутствии сукцината в качестве субстрата (чтобы блокировать эндогенное ЫАО+-зависимое дыхание, в среду добавляли ротенон). Стрелкой ука-; зано добавление ADP. После того как практически весь ADP был профосфо-рилирован, установилась низкая скорость дыхания — состояние 4. Если полагать, что протонная утечка, определяющая дыхание в состоянии 4, сохраняется неизменной и в состоянии 3, то для расчета ADP необходимо учитывать лишь дополнительно поглощенный кислород. Если же предположить, что в состоянии 3 пассивной утечки не происходит и все дыхание используется для синтеза АТР, то для расчета следует учитывать весь использованный кислород. В действительности второе предположение оказывается более точным, так как протонная утечка сильно зависит от Дрн+.и небольшое его снижение (рис. 4.16) приводит к значительному уменьшению утечки. В нашем примере ADP/0 = 500/290= 1,72.

е) протонная проводимость мембраны.

На рисунке 4.1 показаны три основных состояния протонного цикла: разомкнутый цикл, где протоны не могут вернуться в матрикс; замкнутый цикл, в котором возврат протонов сопряжен с синтезом АТР, и замкнутый цикл, где протонная утечка не сопряжена с синтезом АТР. Эти состояния легко могут быть созданы в ячейке 02-электрода (рис. 4.15). Их принято обозначать согласно терминологии, предложенной Чансом и Вильямсом (Chance, Williams, 1955) (табл. 4.1).

Внесение митохондрий в инкубационную смесь (рис. 4.15) приводит к небольшому всплеску дыхания, которое затем устанавливается на низком уровне — состояние 4. Хотя в митохонд-риальном матриксе и содержатся адениновые нуклеотиды, их количество относительно невелико (около 10 нмолей на 1 мг белка), и после начала реакции этот пул быстро фосфорилирует-

ся, пока не достигается равновесие с Ди.ц+. Дыхание в состоянии 4 происходит потому, что внутренняя мембрана митохондрий не абсолютно непроницаема для протонов. Они могут медленно проходить через мембрану даже в отсутствие синтеза АТР. Одним

90 Глава 4

из факторов, определяющих утечку протонов в состоянии 4, является циклический перенос Са2+ через мембрану (разд. 8.4).

Фактором, который в действительности контролирует скорость дыхания, является степень отклонения системы от равновесия между редокс- потенциалом пары в прогонпереносящем

участке цепи и величиной Ацн+ (разд. 3.9). В состоянии 4 дыхание автоматически регулируется таким образом, что выброс протонов дыхательной цепью точно уравновешивает их утечку через мембрану. Если в какой-то момент скорость выхода протонов превысит скорость их входа, то возрастет Др,н + , уменьшится отклонение от равновесия между дыхательной цепью и

Дц.н+, а в результате понизится протонный ток и стационарное состояние восстановится.

На рис. 4.15 показано, как меняется дыхание в состоянии 4, если в среду добавить ADP. ADP проникает в матрикс в обмен на АТР с помощью транслоказы адениновых нуклеотидов (разд. 7.5). В результате AG системы ATP/ADP+Pi в матриксе понижается и нарушается равновесие АТР-синтетазной реакции. Далее последовательно происходит следующее: а) АТР-синте-таза работает в направлении синтеза АТР и протоны при этом переносятся в матрикс; б) вход протонов обусловливает понижение Дцн+ ; отклонение от равновесия между дыхательной

цепью и Дцн+ возрастает; г) с ростом протонного тока увеличивается скорость дыхания. Как и в состоянии 4, в новом состоянии 3adp дыхание саморегулируется так, что скорость выброса протонов уравновешивает возросшую скорость их входа. Синтез АТР и дыхание в состоянии 3adp могут остановиться в трех случаях: а) если фосфорилируется такое количество ADP, что устанавливается термодинамическое равновесие; б) если подавляется обмен адениновых нуклеотидов через мембрану при добавлении такого ингибитора, как атрактилат (разд. 7.6); в) если подавляется АТР-синтетаза, например при добавлении олигомицина (разд. 7.3).

Энергетическое сопряжение между дыхательной цепью и разностью электрохимических потенциалов протонов чрезвычайно эффективно, поэтому даже небольшое отклонение от равновесия в системе вызывает значительные энергетические потоки. Так, из данных рис. 4.16 следует, что после добавления ADP, которое вызывает переход в состояние 3adp с высокой скоростью

дыхания, Д(гн+ снижается менее чем на 30%. Истинное отклонение от равновесия в этом случае еще меньше, так как разность редокс-потенциалов также снижается (разд. 5.3).

Высокая эффективность энергетического сопряжения сохраняется в состоянии Забр и на уровне АТР-синтетазы. Действительно, высокая скорость синтеза АТР поддерживается при

Хемиосмотический протонный цикл

91

очень небольшом отклонении

от равновесия между Дцн+ и АО?.

Протонофоры разобщают окислительное фосфорилирование, повышая протонную проводимость через бислойные участки мембраны (разд. 2.5). Они могут быть использованы для снятия ингибирования входа протонов, возникающего при блокировании синтеза АТР. В результате такие протонофоры, как, например, FCCP, могут индуцировать быстрое дыхание (состояние Зразобщ) независимо от присутствия олигомицина, атрактила-та или отсутствия ADP (рис. 4.14).

Дыхательная цепь отвечает

на снижение Дцн+ при добавке протонофора так же, как и

на снижение Дцн+ за счет синтеза АТР. В обоих случаях скорость выброса протонов (и дыхания) растет до тех пор, пока не уравновесит скорость их входа. В результате устанавливается такая Дцн+ при которой скорости двух Дцн+-за-

Рис. 4.17. Скорость дыхания как

функция Др.н+ (Nichol'ls, Bernson, 1977). Митохондрии бурого жира инкубировали в среде, содержащей глицерол-3-фосфат, олигомицин, блокирующий АТР-синтетазу, и GDP, который ингибирует природную протонную проводимость, характерную для этих митохондрий (разд. 4.5). Параллельно измеряли скорость дыхания и Д(.1п+ при возрастающих концентрациях протонофора.

250

200

/50

/00

50

ADP

--60/SpH

2 4 6 8 Время, мин

Рис. 4.16. После добавления ADP и вызванного им перехода митохондрий печени из состояния 4 в состояние 3 наблюдается лишь небольшое

снижение Дцн+ (Nicholls, 1974). Митохондрии печени крысы инкубировали в сахарозной среде, содержащей в качестве субстрата {5-гидроксибу-тират, 8eRb+ и валиномицин для измерения Дф, а также 14С-метиламин и ЧН-ацетат для измерения ДрН. В момент, указанный стрелкой, добавляли такое количество ADP, которого хватало, чтобы поддерживать дыхание в состоянии 3 в течение 5 мин. Дф и ДрН измеряли с помощью фильтрации митохондрий через мембранные фильтры.

250 г

200 150 100 50

50 100 150

Дыхание, нмопи Омтн'мг''

92 Глава 4

висимых процессов — входа протонов и дыхания — совпадают. Скорость дыхания не возрастает бесконечно при повышении концентрации протонофора, так как достигается состояние, когда скорость определяется кинетическими особенностями дыхательной цепи. Дыхание при этом становится неконтролируемым, т. е. оно не зависит более от степени отклонения от термодинамического равновесия. Это состояние обычно наступает еще при очень высоких значениях Ацн+ (рис. 4.17). В связи с этим важно различать условия, когда отсутствует дыхательный контроль (Ацн+от 0 до 170 мВ; рис. 4.17), и условия,

когда митохондрии полностью деэнергизованы (Аи.ц+ =0).

В электрической цепи проводимость каждого компонента определяется как величина тока через него при разности потенциалов, равной единице. Аналогичный смысл имеет и эффективная протонная проводимость мембраны (СмН+) в протонном цикле;

См Н+ = JH+/ Al7h+ . (4.3)

В табл. 4.3 приведены расчеты величины СмН+ и некоторых параметров, введенных еще до появления хемиосмотической гипотезы, для типичного препарата митохондрий печени (разд. 4.6).

Величина эндогенной протонной проводимости мембраны во многом определяет биоэнергетическое «поведение» данного препарата митохондрий. Как будет показано далее в разд. 4.6, все

Таблица 4.3

Расчет параметров превращения энергии в митохондриях

Изв

страница 16
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Скачать книгу "Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию" (1.67Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.11.2017)