Биологический каталог




Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию

Автор Д.Д.Николс

Глава 4

Ионные потоки

Н+-

(П)

А. Аэробная фаза

H*+Pi —HPi

Б. Анаэробная фаза

Факторы, определяющие СГШ 4рН

-HPi-H++Pi Ш)

Рис. 4.9. Определение соотношения Н+/0 в митохондриях методом кислородных пульсов. Использован тот же прибор, что и дли определения Лцн+ (рис. 4.3), но без К+-электрода. Концентрированную суспензию митохондрий инкубируют в анаэробных условиях в среде с низкой буферной емкостью, содержащей субстрат, валиномицин и КС1 в высокой концентрации. рН-Элект-род должен иметь малое время ответа. Реакцию начинают быстрым добавлением небольшого количества среды, насыщенной воздухом (содержит около 5 нмолей О-мг белка-1). Наблюдается быстрое закисление среды в результате работы дыхательной цепи, которая за 2—3 с использует добавленный Ог. Валиномицин и К+ необходимы для того, чтобы предотвратить образование Лф, который препятствует дальнейшему выбросу протонов. По исчерпании 02 рН среды восстанавливается, так как протоны возвращаются в матрикс. Этот процесс может определяться: (I)—протонной проводимостью мембраны (добавление FCCP ускоряет процесс); (II)—эндогенным Ш+/Н+-анти-портом; (III) —электронейтральным входом Pi (разд. 7.5). Для расчета Н+/0 кривую следует экстраполировать к моменту, когда 02 еще не исчер-лан. В — валиномицин.

Другой метод определения соотношений Н+/0 основан на измерениях начальных скоростей дыхания и выброса протонов при добавке субстрата к лишенным субстратов митохондриям (Brand et al., 1976).

Величины стехиометрических соотношений, определенные этими методами, должны соответствовать требованиям, предъявляемым термодинамикой. Другими словами, энергия, запа-

Хемиосмотический протонный цикл

83

ЛНСгт?™ оСтехИ0метРия. переноса протонов н зарядов в дыхательной цепи Петли в Дыхательной цепи. Б. Конформационные помпы.

Модель а Модель б Н+/2е- q+/2e- Н+/2е- q+/2e-

Комплекс I 2 2 3 з

Комплекс III 4 2 4 2

Комплекс IV 0 2 2 4

Сукцинат — 02 4 4 6 6

6 6 9 9

Отметим, что соотношение q+/2e- отражает движение зарядов через мембра-

Гкон*ооГап^ВнанеТй"мПРОТОНЫ' И электР°ны- Стехиометрические соотношения в конформационнои модели носят, скорее всего, иллюстративный характер.

саемая в протонном градиенте, не должна превышать энергетического потенциала редокс-пары в данном протонпереносящем участке цепи. Известно, что протонпереносящие участки комплексов I и III дыхательной цепи функционируют вблизи состояния равновесия и реакции в них легко могут быть обращены. Следовательно, стехиометрия Н+/2е~ для этих участков может быть приблизительно определена, исходя из чисто термодинами-

84 Глава 4

ческих величин: известных l\Eh (разд. 3.8) и компонентов Литт+.

Измерения точных значений стехиометрии Н+/2е~ для различных участков цепи имеют большое значение, так как с их помощью можно сделать выбор между различными схемами переноса протонов. Прямой механизм переноса групп, предложенный Митчеллом (разд. 1.4), предсказывает точную величину 2Н+/2е_ для каждой «петли» (рис. 4.10). Согласно этой гипотезе, протоны освобождаются в результате переноса электронов между переносчиками Н-атомов (H+ + e~) и чисто электронными акцепторами. Прямой механизм требует также существования ряда структурных особенностей организации дыхательной цепи, которые мы обсудим в разд. 5.4.

Ранние измерения величин Н+/0 методом кислородных пульсов (Mitchell, Moyle, 1967а) дали для участков NADH—>-02 и сукцинат —>-02 значения, близкие к тем, что были предсказаны согласно прямому механизму (соответственно 6 и 4, см. рис. 4.10). Однако после того, как было обнаружено, что N-этилмалеимид, блокирующий симпорт H+/Pj (см. выше), повышает наблюдаемые величины стехиометрии, эти результаты оказались под сомнением.

Если наблюдаемые величины Н+/2е_ действительно слишком высоки для прямого механизма петель, то приходится предполагать существование конформационного сопряжения транспорта протонов и переноса электронов по цепи (разд. 5.4). Такое предположение, в отличие от гипотезы петель, может быть использовано для объяснения любой наблюдаемой стехиометрии. На рис. 4.10 представлены сравнительные характеристики двух гипотетических механизмов. Поскольку в литературе существуют очень большие расхождения в точных значениях стехиометрии Н+/2е~, на рисунке представлены усредненные цифры. Следует отметить, что обе гипотезы предсказывают одинаковую стехиометрию для комплекса III, но, согласно конформационной модели, два дополнительных протона переносятся в комплексе IV (разд. 5.9) и, возможно, один дополнительный протон в комплексе I (разд. 5.6).

4.4. СТЕХИОМЕТРИЯ ПЕРЕНОСА ПРОТОНОВ В АТР-СИНТЕТАЗЕ

(Обзоры: Mitchell, Moyle, 1968; /Vioyle, Mitchell, 1973; Brand, 1977)

Число протонов, переносимых при синтезе одной молекулы АТР, можно рассчитать, измеряя начальный выброс протонов при гидролизе небольшого известного количества АТР или

Хемиосмотический протонный цикл

85

25нмолей АТР

1мин

сравнив термодинамические величины Ацн+ и AGp для реакции синтеза АТР в условиях равновесия. Первый подход аналогичен методу кислородных пульсов (разд. 4.3), только вместо 02 используется АТР. При этом возникает, однако, ряд дополнительных проблем. Во-первых, при АТРазной реакции могут выделяться скалярные протоны [уравнение (3.9)]. Во-вторых, вход АТР и выход из митохондрий ADP и Pi могут сопровождаться переносом протонов (разд. 7.5). Эту вторую трудность можно преодолеть, если работать На вывернутых суб-митохондриальных частицах (разд. 1.4), а, первую — поддерживая рН на таком уровне, когда скалярные протоны не выделяются (Thayer, Hinkle, 1973). В таких экспериментах были получены величины, близкие к 2Н+/АТР для митохонд-риальной АТР-синтетазы (рис. 4.11).

Термодинамический подход был использован как в опытах на митохондриях, так и на суб-митохондриальных частицах, бактериальных везикулах и хлоропластах. В случае интакт-ных митохондрий этот метод чаще всего, но не всегда дает величину, близкую к 3 (рис

Рис. 4.11. Определение стехиометрии H+/ATP в субмитохондриальных частицах (Thayer, Hinkle, 1973). Суб-митохондриальные частицы из сердца быка инкубировали в среде с низкой буферной емкостью, содержащей КС1 и валиномицин. Субстратов дыхания не добавляли. Среда содержала 2 мМ Mg2+, так как АТР реагирует лишь в форме комплекса с Mg2+. Исходный рН составлял 6,1, так что скалярные протоны при гидролизе АТР не выделялись. После того как рН стабилизировался, добавляли 25 нмолей Mg —АТР. В присутствии олигомицина закисления не наблюдалось, а в присутствии про-тонофора (СССР) происходило небольшое закисление, которое затем быстро исчезало.

- --j - - \г-----

4.12). Можно полагать ,что два протона переносятся через АТР-синтетазу, а один — сопряженно с транспортом ADP, Pi и АТР (разд. 7.5).

Стехиометрия выброса протонов дыхательной цепью и обратного входа их при синтезе АТР должна согласоваться с общей наблюдаемой стехиометрией синтеза АТР (разд. 4.6), т. е.

ADP/2e- = Н+/2е" ~ Н+/АТР. (4.1)

Общепринятые максимальные величины ADP/2e~, равные 3 для окисления NADH и 2 для окисления сукцината (разд. 4.6), а также величина Н+/АТР, равная 3 для синтеза и переноса АТР, дают значения Н+/0, равные 9 и 6 соответственно. Эти цифры

86 Глава 4

620 600

580

1 560

540 Ь

520

500

3.0

-'2.5

»90

220

230

200 2/0

Рис. 4.12. Термодинамические соотношения между внемитохондриальным фосфатным потенциалом н Дцн+. Митохондрии бурого жира инкубировали в среде, содержащей в качестве субстрата а-глицерол-3-фосфат; GDP, который блокирует протонную утечку в этих митохондриях (разд. 4.5); валиномицин, ^Rb, |4С-метиламии и аН-ацетат для измерения Дцн+ (разд. 4.2). Среда также содержала ADP и протонофор FCCP в различных субоптимальных концентрациях (разд. 2.5). Для каждой концентрации FCCP после установления стационарного состояния определяли величину Дцв* . В параллельном эксперименте та же среда (но без меченых соединений, необходимых для измерения Дцн+) содержала SH-ADP и FCCP в той же концентрации. После установления стационарного состояния в среде определяли содержание SH-ATP и 3H-ADP и рассчитывали фосфатный потенциал (выраженный в милливольтах). Диагональные штриховые линии показывают, какие наивысшие значения фосфатного потенциала можно получить при данном Др.н+, если при синтезе и транспорте 1 молекулы АТР переносится 2,5 или 3 протона (Nicholls, Bernson, 1977).

лучше согласуются с конформационной моделью, чем с механизмом петель в дыхательной цепи, который предсказывает значения б и 4 соответственно (рис. 4.10).

4.5. ПРОТОННЫЙ ТОК, ПРОТОННАЯ ПРОВОДИМОСТЬ И ДЫХАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ

В предыдущих разделах мы рассматривали проблемы, связанные с генерацией и использованием разности потенциалов в протонном цикле. В этом разделе мы обратимся к факторам, регулирующим протонный ток в цикле.

Величина тока протонов в протонном цикле (Jh+ ) может быть определена, исходя из скорости дыхания и стехиометрии Н+/0:

Jw = dO/dt х Н+/0, (4.2)

Хемиосмотический протонный цикл 87

т. е. для данного субстрата протонный ток пропорционален скорости дыхания. Важнейшие аспекты регуляции скорости мито-.хондриального дыхания были установлены задолго до того, как была сформулирована хемиосмотическая гипотеза. Важным успехом теории явилось объяснение эффекта различных агентов на регуляцию дыхания в рамках их действия на величину протонного тока.

Начиная с 50-х годов одним из главных инструментов при исследованиях митохондрий стал кислородный электрод (рис. 4.13). Кислородный электрод позволяет измерять лишь скорость переноса электронов на кислород, поэтому для того, чтобы изучать с его помощью какие-то митохондриальные процессы, необходимо создать такие условия, когда эти процессы определяют скорость потребления Ог. Такими скоростьлимитирую-щими процессами могут быть (рис. 4.14):

камера

Рис. 4.13. Кислородный электрод Кларка. На платиновом электроде СЧ вос--станавливается до Н20. Если на нем поддерживается отрицательный потенциал 0,7 В относитель

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Скачать книгу "Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию" (1.67Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)