Биологический каталог




Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию

Автор Д.Д.Николс

около 200 мВ, то напряженность электрического поля в мембране превышает 300 000 В-см-1. Неудивительно поэтому, что при генерации Агр некоторые природные компоненты мембран изменяют свои спектральные свойства. Такой электро-

Хемиосмотический протонный цикл

77'

хромизм определяется изменением энергетических уровней электронов в молекуле под действием внешнего электрического поля. Наиболее широко из природных индикаторов Агр изучены пигменты, в частности каротиноиды в сопрягающих фотосинтетических мембранах (разд. 6.3). Электрохромный сдвиг развивается очень быстро (в течение наносекунд или менее), что позволяет исследовать первичные электрогенные реакции при поглощении света (разд. 6.2). Существует, однако, одно важное ограничение при использовании этого подхода. Мембранные пигменты способны реагировать лишь на те электрические поля, которые возникают в непосредственной близости от них. Величины этих полей могут не соответствовать разности потенциалов между водными фазами, измеряемой, например, по распределению ионов. Большое влияние на величину измеряемого электро-хромного ответа оказывает, по-видимому, поверхностный потенциал (разд. 3.6).

Существуют также искусственные спектральные индикаторы Агр и АрН. Некоторые примеры таких молекул, используемых в экспериментах, показаны на рис. 4.6. Пока не описано ни одного искусственного индикатора Агр, который работал бы аналогично каротиноидам, т. е. оставался бы фиксированным в мембране и менял бы спектральные свойства при создании поля.Хо-

А. Катионные Феносафранин

Цианиновые красители, например

Рис. 4.6. Некоторые спектральные индикаторы мембранного потенциала.

78 Глава 4

Валиномицин Сикцинат АТР А Б В

Рнс. 4.7. Сафранин как индикатор Дф в митохондриях (Akerman, Wikstrom, 1976). Митохондрии из клеток печени инкубировали в присутствии ротено-иа, блокирующего дыхание (разд. 5.6). А. Кривая показывает образование диффузионного потенциала величиной 124 мВ после добавления валиномицина. Концентрация К+ в среде составляла 0,96 мМ, а в матриксе принималась равной 120 мМ. Б. Образование Дф было вызвано добавлением субстрата дыхания—сукцината, а рассеивание — добавлением протонофора. В. Дф был образован благодаря гидролизу АТР и снят после добавления ингибитора АТР-еинтетазы — олигомицина (разд. 7.2). Среда инкубации содержала 10 мкМ сафранина. Измерения проводились на двухволновом спектрофотометре (разд. 5.2).

тя искусственные индикаторы широко используются для определения Дф и ДрН, механизмы их ответов часто еще остаются предметом дискуссий. Общим свойством индикаторов, является изменение спектров поглощения (или флуоресценции) при связывании с мембраной или при накоплении внутри органеллы. Это позволяет наблюдать за связыванием или перераспределением индикаторов без отделения органелл от среды инкубации. Многие индикаторы представляют собой большие плоские молекулы, способные к стэкинг-взаимодействиям при повышении их локальной концентрации. При этом понижается их способность поглощать свет, что и лежит в основе, по крайней мере некоторых, спектральных изменений. Сложная природа ответов искусственных индикаторов объясняется тем, что на их величину влияют многие факторы помимо Дф и ДрН. Поэтому измерения с помощью индикаторов требуют очень тщательного контроля всех условий эксперимента. Спектральные ответы всегда следует калибровать, например с помощью создания диффузионных "¦-потенциалов К+ в присутствии валиномицина (разд. 3.6; рис. 4.7).

Хемиосмотнческий протонный цикл

79

4.2.4. ОТНОСИТЕЛЬНЫЙ ВКЛАД Дф И ДрН В Дцн+ (Обзор: Gromet-EIhanan, 1977)

На рис. 4.8 суммированы различные факторы, регулирующие

относительный вклад Дф и ДрН в суммарную величину Дц.н+. Если исходить из деэнергизованной органеллы, например митохондрии, то работа протонной помпы (если не учитывать работу всех других митохондриальных систем) приведет к образованию

Аитг+, основным компонентом которого является Дф. В случае митохондрий электрическая емкость мембраны такова, что перенос 1 нмоля Н+ на 1 мг белка приводит к образованию Дф около 200 мВ. Буферная емкость митохондриального матрикса составляет около 20 нмолей Н+ на 1 мг белка на единицу рН и, следовательно, при потере 1 нмоля Н+ рН матрикса повысится лишь на 0,05 (что соответствует —60 ДрН = 3 мВ). Таким

образом, Дин+в этих условиях на 99% представлен в форме мембранного потенциала (рис. 4.8, Б).

А Б

В Г Рис. 4.8^ Факторы, контролирующие относительный вклад Дф и ДрН в величину Дцн+. А, Деэнергизованные митохондрии (Дф=0; — 60ДрН=0; Д}гн+ *• = 0). Б. После включения дыхания Дф очень высокий, а —60 ДрН очень низкий (Др-н+=220 мВ). В. В результате образования Дф начинается электро-форетическое накопление катиона: Дф снижается, —60 ДрН возрастает и восстанавливается Дцн+=220 мВ. Г. В ответ на образование ДрН происходит электронейтральное накопление слабой" кислоты; Дф возрастает, —60 ДрН

снижается, сохраняется Д(Хн+=220 мВ, может происходить набухание. Ас — ион ацетата, / — валиномицин.

80 Глава 4

При образовании Дцж- может происходить перераспределение проникающих ионов (рис. 4.8, В). Перенос К+ в присутствии валиномицина или перенос Са2+ (разд. 8.4) приводит к рассеиванию Агр и, следовательно, понижению Ацн+- При этом происходит дополнительный выброс протонов дыхательной цепью и повышение АрН. Перенос 20 нмолей К+ (или 10 нмолей Са2+), уравновешенный выбросом 20 нмолей Н+, приведет, если учитывать буферную емкость матрикса, к образованию АрН около единицы (—60АрН = 60 мВ). Поскольку дыхательная цепь может создать лишь Ди.н+, не превышающий исходный, то после переноса ионов конечная величина Агр снизится на 60 мВ. Таким образом, перенос катионов приводит к перераспределению

компонентов Ди.н+ : АрН растет, Агр падает. Понижение Агр в этих условиях будет приводить к снижению уровня переноса ионов, пока система не достигнет электрохимического равновесия [уравнение (3.28)]. Например, накопление Са2+ в митохондриях в обмен на протоны ограничено примерно 20 нмолями Са2+ на 1мг белка (разд. 8.4). При этом Дгр снижается (и —60 ДрН возрастает) на 120 мВ.

Третий фактор, который может влиять на относительный вклад Дгр и ДрН, —это перераспределение электронейтральных проникающих форм слабых кислот и оснований (рис. 4.8, Г). Например, накопление слабой кислоты в ответ на образование ДрН, возникшего при переносе катионов, будет приводить к рассеиванию ДрН и возрастанию Дгр за счет работы дыхательной цепи. Возникает ситуация, когда в митохондриях накапливаются и катионы, и анионы. Если их количество достаточно велико, то это приведет к осмотическому набуханию митохондрий (разд. 2.7). Однако этот эффект не наблюдается, если в митохондриях накапливается Са2+ и Pj. Они образуют осмотически неактивный комплекс, и осмотическое давление в матриксе не повышается (разд. 8.4).

Из сказанного становится ясно, что индикаторы АрН и Агр, которые сами являются проникающими ионами, слабыми кислотами или слабыми основаниями, могут изменять величины измеряемых градиентов, если не принять мер предосторожности. Это особенно важно при использовании валиномицина, так как концентрация К+ в матриксе очень высока и измеряемая величина будет определяться величиной исходного градиента К+. Эта опасность значительно меньше в опытах с синтетическими катионами, такими, как ТРМР+ которые используются в очень низких концентрациях.

Некоторые примеры характерных величин Дгр и ДрН для различных сопрягающих мембран приведены в табл. 4.2.

Хемиосмотический протонный цикл

81

4.3. СТЕХИОМЕТРИЯ ПЕРЕНОСА ПРОТОНОВ В ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ

(Обзоры: Papa, 1976; Mitchell et а!., 1979; Reynafarie et al., 1979; Wikstrom, Krab, 1980)

Протонный ток, генерируемый дыхательной цепью, нельзя прямо измерить в стационарных условиях, так как при этом потоки протонов, направленные наружу и внутрь, равны. Можно, однако, измерить начальный выброс протонов при быстром включении дыхания, пока обратный поток еще не установился. Добавляя небольшие точно отмеренные порции 02 к суспензии митохондрий, находящейся в анаэробных условиях в присутствии субстрата дыхания, и измеряя выброс протонов быстро реагирующим рН-электродом, можно определить величины стехиометрии Н+/0 для участка дыхательной цепи между данным субстратом и 02. Практические детали такого эксперимента приведены на рис. 4.9. Для того чтобы получить точные результаты, необходимо соблюдать ряд предосторожностей. Во-первых, должна существовать катионная проводимость, способная скомпенсировать выброс протонов и предотвратить образование Дгр, который бы препятствовал дальнейшему выбросу Н+ (разд. 4.2). Во-вторых, количество добавленного 02 должно быть настолько мало, чтобы возникающий ДрН не достигал уровня насыщения. В-третьих, даже при быстром включении дыхания и низкой протонной проводимости какая-то часть протонов успевает вернуться в матрикс (и, следовательно, не будет зарегистрирована), прежде чем завершится начальный всплеск дыхания. Эта опасность возрастает, если в среде присутствует фосфат, который почти всегда есть и в препаратах митохондрий. В митохондриях имеется очень активный переносчик, осуществляющий симпорт H^/Pi (разд. 7.6). Таким образом, при включении дыхания и образовании АрН вместе с протонами в матрикс переносится Pj и измеряемая величина Н+/0 занижается. При инги-бировании фосфатного переносчика N-этилмалеимидом наблюдаемые величины Н+/0 значительно повышаются (Brand et al., 1976, но см. также Moyle, Mitchell, 1978а). Существуют две модификации метода кислородных пульсов. Во-первых, вместо пульсов 02 можно использовать другие акцепторы электронов, что позволяет исследовать раздельно различные участки дыхательной цепи. В этом случае вместо коэффициента Н+/0 используется величина Н+/2е- Во-вторых, измеряя транспорт К+, вместо стехиометрии переноса протонов можно определять стехиометрию переноса зарядов (q+/0 или q+/2e~). Даже в том случае, когда не происходит транспорта никаких других веществ, кроме К+ и Н+, стехиометрии по протону и по заряду могут не совпадать (рис. 4.10).

82

страница 14
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Скачать книгу "Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию" (1.67Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.06.2017)