центрации индикатора в среде по мере его накопления в органелле. В некоторых случаях удается использовать изменение спектральных свойств индикаторов при их накоплении в органеллах. Далее мы рассмотрим примеры использования этих подходов.

4.2.1. ИЗМЕРЕНИЕ Дцн+ С ПОМОЩЬЮ ИОНСЕЛЕКТИВНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ

(Обзоры: Rottenberg, 1975, 1979а, Skulachev, 1979)

При первом измерении Дц.н+ в митохондриях (Mitchell, Moyle, 1969а) были использованы селективные рН- и ^-электроды в анаэробных условиях (рис. 4.3). В среде присутствовал валиномицин, обеспечивающий электрофоретический унипорт К+, и Дф измеряли по количеству К+, вошедшего в митохондрии после добавки небольшого количества 02. ДрН определяли по параллельному выбросу протонов. Была получена величина

Дц.н+, равная 228 мВ и характеризующая «разомкнутую цепь», так как синтеза АТР не происходит (состояние 4 в табл. 4:1).

Сходный метод был разработан в лабораториях В. П. Ску-лачева и Е. А. Либермана для измерения Дг]т в различных ор-

72 Глава 4

ганеллах. Вместо К+ и валиномицина были синтезированы катионы и анионы, заряд которых был делокализован и экранирован гидрофобными группами, так что они могли в заряженной форме проникать через бислойные участки мембраны (разд. 2.5). В оригинальной методике измерение падения концентрации иона при его накоплении в органелле проводилось с помощью плоской бислойной липидной мембраны (разд. 1.3), разделяющей ячейку на два отсека: второй отсек содержал тот же про-

О

рН-Злектрод

Электрод сравнения

-К* Селектив-1 иый | электрод у\

Отверстие _Эля внесения добавок

Анаэробная среда

«о га

О qj

Е ь

ни D CJ

со га 5

О 0) о.

О. Cl е ь am,

1 э

Анаэробное добавление НС1

Н,0,

СреЭа | | Матрикс

Валиномицин

Рис. 4.3. Определение Atp и ДрН с помощью ионселективных электродов. А. Прибор. Б. Определение буферной емкости матрикса. В. Эксперимент. Г. Ионные потоки. Митохондрии инкубируют в анаэробных условиях, среда содержит сахарозу, субстрат, валиномицин и К> в низкой концентрации. Затем добавляют такое количество Н202, которое позволяет дыхательной цепи работать около 3 мин (среда содержит каталазу). При этом наблюдается выброс протонов (измеряется рН-электродом) и захват ионов К+ (измеряется К+-селективным электродом). Распределение ионов К+ в присутствии валиномицина подчиняется уравнению Нернста. Зная объем матрикса, в котором накапливается К+, и измерив падение концентрации К+ в среде, можно рассчитать величину градиента К+ на мембране. Чтобы рассчитать величину ДрН, необходимо знать как падение внешнего рН, так и повышение рН в матриксе, а для этого необходимо измерить его буферную емкость. Эту величину определяют в независимом эксперименте, где измеряют за-кисление среды после анаэробной добавки НС1. Наблюдаемое начальное закисление соответствует буферной емкости среды. Затем происходит частичное защелачивание, связанное с входом протонов в матрикс. Конечное состояние отражает суммарную буферную емкость среды и матрикса.

Хемиосмотический протонный цикл 73

Таблица 4.1

Состояния дыхания1)

Дыхание

Состояние 1 Митохондрии Без субстрата Нет ADP Низкое

Состояние 2 » То же ADP »

Состояние 3 » Субстрат » Высокое

Состояние 4 » » ADP исчерпан Низкое

Состояние 5 » » Кислород исчерпан

Состояние 3 можно подразделить на:

Состояние Зраз0бщ:высокая скорость дыхания достигается благодаря добавлению протонофора

Состояние 3ADP : высокая скорость дыхания достигается благодаря добавлению ADP

Состояние 3 -j-: промежуточное состояние, когда скорость дыхания определяется скоростью образования ADP (физиологическое) Состоянием 6 называют состояние подавленного дыхания, которое иногда наблюдается при возникновении большого ДрН в результате накопления Са2+ в отсутствие проникающего аниона.

') Первоначальная классификация состояний дыхания (Chanse, Williams, 1956) соответствовала последовательности добавок при измерении дыхания с помощью кислородного электрода, как показано на рис. 4.17.

никающий ион, но не содержал энергизованных органелл. Разница в концентрации ионов между отсеками создавала на искусственной мембране потенциал, который измерялся электродами. Мембрана, таким образом, работала как ионселективный электрод. Этот метод позволял свести к минимуму снижение потенциала, которое наблюдалось в опытах с К+ и валиномици-ном, так как в матриксе содержится до 100 мМ К+ (см. ниже). Опыты с синтетическими ионами исключали также возможность участия специфических ионных помп, использующих энергию химического интермедиата (разд. 1.4).

Многие из этих ионов в настоящее время выпускаются в виде радиоактивных изотопов, и их можно использовать для измерений Агр с помощью изотопной техники.

4.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Агр И АрН ПО РАСПРЕДЕЛЕНИЮ МЕЧЕНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

(Обзоры: Nicholls, 1974; Rottenberg, 1975, 1979; Ramos et al. 1979)

Определение Агр и АрН по равновесному распределению меченых соединений можно проводить без отделения органелл от среды инкубации с помощью метода проточного диализа

74 Глава 4

От перистальтического насоса

Среда, содержащая меченый индикаторный ион

Диализная мембрана

К коллектору фракций

Б

70 20 30 40

Шйлер фракции

Рис. 4.4. Определение Дф в субмитохондриальных частицах методом проточного диализа (Sorgoto et al., 1978). В верхнем отсеке диализной ячейки (А) содержится: 20 мкмоль/л 14CNS (проникающий анион); NAD+, этанол и алко-гольдегидрогеназа (образующие NADH-регенерирующую систему, которая поддерживает постоянную концентрацию субстрата); ацетат, который предотвращает образование ДрН. Там, где указано (Б), добавляются субмито-хондриальные частицы (СМЧ). При накоплении 14CNS в СМЧ концентрация изотопа в среде понижается, что приводит к строго пропорциональному снижению скорости его диффузии через диализную мембрану. При добавлении FCCP Дф рассеивается, что приводит к выходу изотопа из СМЧ и повышению скорости его диффузии через диализную мембрану.

(рис. 4.4). Концентрацию индикаторного вещества при этом измеряют по скорости его диффузии через полупроницаемую мембрану в отсек, через который протекает та же среда. Однако этот метод имеет те же ограничения по чувствительности, что и методы измерения концентраций с помощью электродов. Действительно, в большинстве случаев внутренний объем органелл примерно на три порядка меньше, чем объем среды. В этих условиях метод, который позволяет определять концентрации веществ непосредственно внутри органелл, будет иметь гораздо более высокую чувствительность, чем измерения падения концентрации в среде, даже с учетом трудносгей, возникающих при отделении органелл.

Методика разделения должна быть достаточно быстрой, чтобы исключить артефакты, связанные с перераспределением индикаторов в процессе разделения. В методике должно учитываться также остаточное загрязнение органелл средой инкубации. Наиболее широко применяются два метода разделения: центрифугирование через силиконовое масло (рис. 4.5) и филь-

>> о

о

-У 2-5 S 2

оо

та

вдел о "

Eg?

^ С}

од си

х> по*

О "

-о

•с —

о с/Э

см

сл см

о см

оо

+

+

о оо

ю о

Cft

о о

¦О

et

О си

в

J3 н

ar а

s « s

qj а д

s 3 re

в Я n

Ч ч cu

qj я h

о « Ч

a? s

U w-

IX 14

сл

и

- . о

-, о

« 3-

о

в

о

го ? я Щ

*> 2 ^ ¦а ч w

в я g

щ Н Ч г «) О

S s s t=tr\ >=t

q.2 >а в 3

"SB га

a

о т о -Я

t<

я

в

as s

в2-к

5 5

о «3 а)

с-о га

2 си Я *

7 о о>

В 5

И2 я

У в

Ы щ

и Я

О

В

is

s 1

о> Ч

я я

к Й о о

ч ?

га и а>

CU (и

га со - &

о У е §

я 1

к о га о-

g е §-а >* §

о

и

•я

8 Я

'5 о 5 о. S *

В X

8 §

Q

< 2

>> U

п

U

о

« S-

2 (и

ни

о

8

я ?

ир) ча(

>я ые

55 в

CU >д

>>

ИИ (б S *v S Ef |2

CU В о

p О

Ihtoxoh, убмитох тицы (

с )

ttl

ч

ч а

о

CU

о ч

о

•е-

8

1 о о.

76 Глава 4

трация через миллипоровые фильтры. Оба они имеют свои преимущества и недостатки. Центрифугирование через масло —более точный метод (при его использовании меньше загрязнение средой инкубации), но он требует большего времени для разделения. Фильтрация менее точна (ее ограничения связаны с ко-

ИнкуРационная ' смесь с

митохондриями - Масло

Среда инкубации

Масло

Осадок митохондрии

До центрифугирования

После центрифугирования

Рис. 4.5. Определение Агр с помощью центрифугирования митохондрий через силиконовое масло. Митохондрии инкубируют в среде, не содержащей К+, в присутствии валиномицина, 86Rb+, 14С-сахарозы и 3Н20. Аликвоту суспензии помещают в небольшую пробирку, содержащую силиконовое масло, и центрифугируют при 10 000 g в течение 1 мин. Митохондрии образуют под слоем масла осадок, который можно затем растворить для жидкостно-сцинтил-ляционного счета. Определяют также радиоактивность в надосадочной жидкости. Наличие в среде 14С-сахарозы позволяет определить доступный для сахарозы объем в осадке (Усах). Он соответствует загрязнению осадка вне-митохондриальной средой инкубации. Разность между объемом, доступным для 3Н20(Ув), и Усах дает величину объема, недоступного для сахарозы, который соответствует объему матрикса (так как через внутреннюю мембрану проникает не сахароза, а вода). Если теперь определить в осадке кажущуюся величину объема, доступного для 8eRb (Ум), то по уравнению Нерн-

(^Rb-Vcax)

ста можно рахчитать мембранный потенциал = 591g

(Ув - Vcax)

личеством материала, который можно отфильтровать, и большим объемом промывающей среды), но зато это более быстрый и простой метод. В обоих случаях среда инкубации должна содержать непроникающее меченое вещество, по которому судят о загрязнении органелл средой. В табл. 4.2 приведены некоторые комбинации изотопов, которые применяются для измерения Агр и АрН.

4.2.3. СПЕКТРАЛЬНЫЕ ИНДИКАТОРЫ Агр И АрН

(Обзоры: Waggoner, 1976; Bashford, Smith, 1979)

Если на сопрягающей мембране существует мембранный потенциал (Агр)