Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

стохимии для выявления отдельных классов веществ. Метод замораживания—высушивания используется лишь тогда, когда нельзя обойтись без немедленной стабилизации ткани.

2.1.7.6.1. БЕЛКИ

Стабилизация белков лучше всего удается при фиксации методом замораживания—высушивания. Белки при этом денатурируются лишь незначительно. Данных об использовании метода замещения в замороженном состоянии для фиксации белков недостаточно. Поэтому химическая фиксация продолжает играть важную роль. Из приведенных в табл. 6 фиксирующих средств для стабилизации специфических групп наиболее пригодны смеси с этанолом, поскольку они слабо реагируют с активными группами белков. Формальдегид имеет то преимущество, что его реакции с белками хорошо изучены; известно также, что эти реакции обратимы. Кроме того, следует отметить, что не упомянутые в табл. 6 и 7 фиксирующие смеси, содержащие тяжелые металлы и пикриновую кислоту (например, Ценкера, Буэна, Суза), также могут быть использованы в гистохимии белков.

2.1.7.6.2. ПОЛИСАХАРИДЫ

Для общего выявления углеводов рекомендуется фиксация в смесях формальдегида с этанолом при температу-ре'от 0 до + 4° С. Кислые мукоидные вещества очень хорошо осаждаются цетилпиридинийхлоридом. В смеси с формальдегидом он является хорошим фиксатором для этой группы веществ. Очень хорошие результаты при выявлении кислых мукоидных веществ достигаются путем использования окраски альциаиовым синим и реакций связывания железа. Смеси, содержащие хлорид ртути или пикриновую кислоту, также дают хорошие результаты. Наилучшая стабилизация слизистых веществ достигается, по-видимому, замораживанием — высушиванием с последующей фиксацией в парах формалина. Для электронно-микроскопического выявления мукоидных веществ хоро-

46 2. Методы гистохимии

шо себя зарекомендовали смеси с глутаральдегидом и формальдегидом.

Адекватная фиксация гликогена, соответствующая его прижизненной локализации, весьма затруднительна. При помощи рекомендуемых методов получить постоянные результаты на различном материале весьма затруднительно. Частично это объясняется наличием различных легкорастворимых разновидностей гликогена. При обычной гистологической фиксации в срезах сохраняются лишь большие молекулы высокомолекулярного гликогена, тогда как гликоген меньшей степени полимеризации легко вымывается. Поэтому желательно для каждого материала подбирать наилучший фиксатор путем предварительных проб. С тем чтобы снизить потери гликогена и избежать артефактов его смещения, при выборе фиксирующей смеси следует по возможности согласовать ее состав и температуру фиксации.

1

2.1.7.6.3. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

При оценке результатов фиксации следует учитывать, что нуклеиновые кислоты существуют в различных полимерных формах. Очевидно, что каждое фиксирующее вещество вызывает изменения как в степени полимеризации, так и в способности вступать в химические реакции. Не рекомендуется применять фиксаторы, блокирующие реак-ционноспособные группы и таким образом ослабляющие окрашиваемость нуклеиновых кислот (например, формальдегид). Хорошую сохранность структур обеспечивают кислые фиксирующие смеси, такие, как этанол-уксусная кислота и смесь Карнуа. Они, кроме того, постепенно разрывают связи между нуклеиновыми кислотами и белками и таким образом увеличивают число реакционноспо-собных кислых групп, что способствует хорошей окраши-ваемости основными красителями. Следует, однако, учитывать, что длительная фиксация в кислых смесях ведет постепенно к экстрагированию сначала РНК, а затем ДНК. В критических случаях (например, при цитофотоме-трическом количественном определении нуклеиновых кислот) следует согласовывать продолжительность фиксации с величиной объекта и температурой. Наиболее рацио-

2. Методы гистохимии 47

нальной считается фиксация объектов величиной 2—3 мм в течение 2 ч при 2°С в фиксаторе Карнуа (табл. 7).

2.1.7.6.4. ЛИПИДЫ

Для фиксации липидов наиболее часто используется формальдегид, который может изменять физические свойства липидов (растворимость, дисперсия, первичная флуоресценция и др.). Возможное в процессе фиксации частичное растворение и вымывание липидов, особенно фосфолипидов, можно в значительной мере ограничить добавлением в фиксирующую смесь ионов Са, Со или Cd, поскольку эти электролиты способствуют образованию комплексов между липидами и белками. Поэтому фиксирующая смесь Бейкера, содержащая формальдегид и кальций, широко используется в гистохимии липидов. Фиксация липидов формальдегидом в значительной мере предотвращает растворение липидов в процессе обезвоживания и заливки тканей в полиэтиленгликоль или карбо-вакс. Другая возможность предотвращения вымывания липидов, особенно фосфолипидов, в органических растворителях, используемых при заливке в парафин, заключается в добавлении в фиксирующую смесь бихроматов. Длительное хромирование при высоких температурах позволяет обеспечить сохранность нейтральных жиров при заливке в парафин. Хорошим дополнением к фиксации общих липидов формальдегидом служит рекомендуемая Элфтманом (Elftman) фиксация тканей (за исключением нервной) в смеси растворов сулемы и бихромата (табл. 7).

*~Для большей точности следует параллельно окрасить и нативную ткань. Нативные замороженные срезы можно окрасить, помещая их в раствор краски или в свободном виде, или закрепленными на покровном стекле.

2.1.7.6.5. ФЕРМЕНТЫ

При первых попытках гистохимического выявления гидролитических ферментов для фиксации предпочитали холодный ацетон или этанол, поскольку обе эти жидкости вызывают лишь незначительную инактивацию фермента. При последующей заливке в парафин процесс обезвожива-

Таблица 7

Фиксирующие смеси для гистохимического выявления нуклеиновых кислот и липидов

Продолжительность фиксации Применение

Класс веществ Фиксирующие смеси Состав Температура фиксации, С групп* микро- Применение

вешеста скопия

Нуклеино- Смесь Карнуа 96%-ный эта- 2ч + 2° ДНК и Свето- Особенно пригод-

вые кис- по Зандритте- нол - 60 мл; хлороформ -30 мл; уксусная кислота-10 мл РНК вая на для количе-

лоты ру (Sandritter) ственного изучения нуклеиновых кислот в сочетании с окраской хромовые квасцы - галлоцианин

Липиды Калыдий-фор- 40%-ный фор- 16-24 ч, + 4° Общие ли- » Добавление 1%

мол по Бей- мальдегид - срезы - пиды Co(NOj), или 1% Cd; особенно пригодна для выявления липидов в нервной ткани

керу (Baker) 100 мл; 10%-ный хлорид , кальция (без-водный)-10 мл; дистиллированная 10 мин

вода - 500 мл Усиление стабилизации липидов благодаря обработке ежедневно заменяемым 2,5%-ным бихроматом калия: менее пригодна для выявления липидов в нервной ткани

Липиды Бихромат калия со ртутью по Элфтману (Elftman) Хлорид ртути (HgCL)-5r; бихромат калия-2,5 г; дистиллированная вода -100 мл 3 дня i Комнатная Фосфолипиды после заливки в парафин .и 2. Методы гистохимии 49

ния в меньшей степени влияет на ферментативную активность, чем температура заливки. Гистохимически выявляемая активность некоторых гидролитических ферментов, особенно фосфатаз, сохраняется лишь в том случае, когда заливка проводится при температурах ниже +50° С, пропитка парафином завершается за 30 мин (заливка в вакууме).

Удовлетворительная сохранность активности гидролитических ферментов достигается при фиксации в предложенном Холтом и Хиксом растворе забуференного формалина (4%), к которому добавляют 7,5%-ную сахарозу, с последующей обработкой в смеси сахарозы с гуммиарабиком или с гуммиакацией при температуре от 0 до + 2°С в течение 1—24 ч (табл. 8). Такая дополнительная обработка положительно сказывается на сохранности ферментативной активности и на получении срезов ткани.

Данные, касающиеся стабилизации связанных и растворимых оксидоредуктаз, приведены в табл. 9. Наиболее чувствительной по отношению к химической фиксации оказалась цитохромоксидаза. Хорошая сохранность активности этого фермента, по-видимому, возможна лишь при фиксации замораживанием—высушиванием. Сукци-натдегидрогеназа достаточно хорошо стабилизируется холодным ацетоном. Однако нельзя не отметить определенных трудностей, связанных с последующей обработкой ткани и с обеспечением сохранности структуры.

Заслуживает внимания предложенная Уокером и Зелиг-маном (Walker, Seligman) возможность стабилизации связанных и растворимых дегидрогеназ фиксацией в формальдегиде низкой концентрации (0,7—2%). Стабилизация растворимых дегидрогеназ достигается также с помощью забуференных растворов глутаральдегида при непродолжительной фиксации.

Значение моно- и диальдегидов для фиксации ферментов при ультраструктурных исследованиях сегодня неоспоримо (табл. 10). Из перечисленных в табл. 10 фиксаторов наименьшим инактивирующим действием обладают глиоксаль, оксиадипинальдегид или адипинальдегид, тогда как 6%-ный глутаральдегид вызывает наиболее сильную инактивацию. Таким образом, хорошая сохранность структур, достигаемая при помощи глутаральдегида, со-

Таблица 8

Фиксирующие смесн для гистохимического выявления ферментов

Фиксирующая смесь

Состав

Продолжительность фиксации

Температура фиксации, ° С

Применение

фермент/группа ферментов

микроскопия

Примечания

Ацетон

Формальдегид Формальдегид-метанол по Каплову (Kaplow) Формальдегид по Холту (Holt)

Кальций-формол по Холту (Holt и. Mitarb.)

Глутаральдегид по Вайсенфель-су (Weissen-fels)

Формальдегид-сахароза-аммиак по Пирсону (Pearson)

Абсолютный ацетон, 80%-ный ацетон

4-10%

40%-ный формальдегид -10 мл; метанол -90 мл

40%-ный формальдегид-100 мл; 0,067 М фосфатный буфер-500 мл; сахароза-75 г

4%-ный формальдегид с 1% СаС12; доведение рН до 7,0 дальнейшим добавлением СаС12

2%-ный глутаральдегид в 0,05 М какодилатном буфере, рН 7,4; добавление 0,5% Са С12

4%-ный формальдегид-10 мл; сахароза-15 г; 0,880 аммиак 1 мл; дистиллированная вода до 100 мл_

24 ч

10-16 ч 30 с

18-24 ч

18-24 ч

12 мин

18-24 ч

-М°

-М°

На льду<

страница 8
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.05.2019)