И

Интерференционный микроскоп с очень высокой надежностью позволяет определять общее содержание белка в живых клетках и абсолютные величины сухой массы. Комбинируя этот метод с методами специфического выявления белков, можно выразить в единицах сухой массы количество выявляемого соединения или какого-либо компонента клетки (Ruch). Из многочисленных возможностей применения интерференционной микроскопии следует упомянуть определение потерь веществ, обусловленных подготовкой материала, и определение толщины микротомных срезов.

7. Количественная гистохимия 317

7.3.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИЙ ОКРАШИВАНИЯ

Несмотря на многочисленные трудности, обусловленные главным образом многообразием и сложностью

Таблица 51

Обзор методов количественной гистохимии (Sandritter, 1965)

X, нм

Выявляемое вещество и реакция окрашивания

Метод

800 700 600

500

400

300 200

10

1

0,1

0,01

Гистон

Тирозин

Триптофан

Аргинин

ДНК

РНК

SS + SH Свободные основные группы Гемоглобин

Прочный зеленый, рН 8,2 (Millon)

Гек, тетразониум

(Sakaguchi)

Реакция Фёльгена

Окрашивание галлоцианин — хромовые квасцы Вагг-nett, Bahr)

Нафтоловый желтый S, Прочный зеле ный, рН 1,2

Сухой вес

Na, Mg, Р, S, С1, К, Са, Fe, Си

Ag, I и т.д.

Цнтофото-метрия в видимой области

Пигменты

Пиридин-нукле-

отиды

Цитохром

Липофуксин

Гемосидерин и

др.

Тирозин-триптофан

Нуклеиновые кислоты

Интерференционная микроскопия

Сухой вес

Ультрафиолетовая микрофотометрия

Микрорентгенография

Рентгеновская гис-тоспект-роскопия

318 7. Количественная гистохимия

белковых молекул, а также иногда недостаточной воспроизводимостью метода, количественная гистохимия белков, основанная на использовании реакций окрашивания, продолжает развиваться. При условии специфичности реакции и линейности соотношения между количеством выявляемого вещества и оптической плотностью с помощью реакций окрашивания обычно удается выражать количество выявляемых веществ лишь в относительных единицах. Абсолютные величины можно получать с привлечением сравнительных исследований на стандартных объектах известного состава.

Специфичность реакции окрашивания реакционноспо-собных групп зависит от процедуры подготовки субстрата и окрашивания, а также от качества красителя. Имеет значение использование апробированных оптимальных методов фиксации, поддержание постоянной температуры в процессе всей процедуры подготовки препарата и использование стандартизованных химически чистых красителей. Для установления специфичности реакции необходимо также привлекать методы торможения. Оценка белковой реакции, как правило, проводится по спектрам поглощения. Наиболее известные реакции Перечислены в табл. 51.

8. БУФЕРНЫЕ СМЕСИ

ОДМ АЦЕТАТ-УКСУСНОКИСЛЫЙ БУФЕР, рН 3,5—5,6

МАТОЧНЫЙ РАСТВОР

А) 0,2 М раствор ацетата натрия (16,4 г/1000мл) Б) 0,2 М уксусная кислота (12,0 мл/1 ООО мл) хмл раствора А + хмл раствора Б

рн А Б рн А Б

3,6 3,7 46,3 4,8 30,0 20,0

3,8 6,0 44,0 5,0 35,2 14,8

4,0 9,0 41,0 5,2 39,5 10,5

4,2 13,2 36,8 5,4 41,2 8,8

4,4 19,5 30,5 5,6 45,2 4,8

4,6 24,5 25,5

0,05 М КАКОДИЛАТНЫЙ БУФЕР, рН 5,0—7,4

МАТОЧНЫЙ РАСТВОР

0,1 М какодилат натрия [Na(CH3)2-As02-3H20, 21,4 г/1000мл!

Маточный раствор 100 мл

0,1 и. HQ хмл

Дистиллированная вода до 200мл

320 8. Буферные смеси

рн ),1н.НС рн ),1и.НС1

5,0 93,5 6,4 36,5

5,2 90,1 6,6 26,6

5,4 85,2 6,8 18,6

5,6 78,4 7,0 12,6

5,8 69,6 7,2 8,3

6,0 59,1 7,4 5,4

6,2 47,7

ВЕРОНАЛ-АЦЕТАТНЫ Й БУФЕР, рН 2,62—9,16

МАТОЧНЫЙ РАСТВОР

А) 9,714 г ацетата натрия + 14,714 г веронала натрия (барбитала натрия) растворить в 500мл дистиллированной воды

Б) 0,1 н. НС1 (8,4 мл/1000 мл) Буферный раствор: Маточный раствор А 5 мл

Маточный раствор В х мл

Дистиллированная вода у мл

рН Б Дистиллированная вода рн Б Дистиллированная вода

2,62 16,0 2,0 6,99 6,0 12,0

3,20 15,0 3,0 7,25 5,5 12,5

3,62 14,0 4,0 7,42 5,0 13,0

3,88 13,0 5,0 7,66 4,0 14,0

4,13 12,0 6,0 7,90 3,0 15,0

4,33 11,0 7,0 8,18 2,0 16,0

4,66 10,0 8,0 8,55 1,0 17,0

4,93 9,0 9,0 8,68 0,75 17,25

5,32 8,0 10,0 8,90 0,5 17,50

6,12 7,0 п,о 9,16 0,25 17,75

6,75 6,5 11,5 _8. Буферные смеси 321

0,05М 7РИС-МАЛЕАТНЫЙ БУФЕР, рН 5,2—8,6

МАТОЧНЫЙ РАСТВОР

0,2 М mpuc-малеатного раствора (24,2 г трисоксиметиламинометана + 23,2 г малеиновой кислоты или 19,6 г малышового ангидрида на 1000 мл дистиллированной воды)

50мл маточного раствора + хмл 0,2н. NaOH + -(-Дистиллированная вода до 200 мл.

рн 0,2 н. NaOH рН ),2 н. NaOH

5,2 7,0 7,0 48,0

5,4 10,8 7,2 51,0

5,6 15,5 7,4 54,0

5,8 20,5 7,6 58,0

6,0 26,0 7,8 63,5

6,2 31,5 8,0 69,0

6,4 37,0 8,2 75,0

6,6 42,5 8,4 81,0

6,8 45,0 8,6 86,5

0,05М Na-МАЖАТНЫЙ БУФЕР, рН 5,2—^,8 МАТОЧНЫЙ РАСТВОР

0,2 М раствор гидрата окиси натрия и малеата (23,2 г малеиновой кислоты или 19,6 г малеинового ангидрида + +"8 г NaOH/ЮООмл дистиллированной воды)

50 мл маточного раствора + хмл ОД н. NaOH + + Дистиллированная вода до 200 мл

рн 0,2 в. NaOH рн D,2 н. NaOH

5,2 7,2 6,2 33,0

5,4 10,5 6,4 38,0

5,6 15,3 6,6 41,6

5,8 20,8 6,8 44,4

6,0 26,9

322 ' 8. Буферные смеси

0,05М ТРИС-НО БУФЕР, рН 7,19—9,10 МАТОЧНЫЙ РАСТВОР

0,2 M трисоксиметиламинометан (24,2 г на 1000мл дистиллированной воды)

Маточньп, раствор Дистиллированная вода

23 мл до мл

рН о,1 н. на рН о,1 н. на

7,19 45,0 8,23 22,5

7,36 42,5 8,32 20,0

7,54 40,0 8,41 17,5

7,66 37,5 8,51 15,0

7,77 35,0 8,62 12,5

7,87 32,5 8,74 10,0

7,96 30,0 8,92 7,5

8,05 27,5 9,10 5,0

8,14 25,0

ОДМ ФОСФАТНЫЙ БУФЕР, рН 5,7—8,0

МАТОЧНЫЙ РАСТВОР '

А) 0,2 М раствора NaH2P04H20 (27,58 г/1000мл) Б) 0,2 М раствора Na2HP04 (28,38 г/1000 мл)

хмл раствора А + у мл раствора В + Дистиллированная

вода до 200мл

рН А Б рН А Б

5,7 93,5 6,5 6,9 45,0 55,0

5,8 92,0 8,0 7,0 39,0 61,0

5,9 90,0 10,0 7,1 33,0 67,0

6,0 87,7 12,3 7,2 28,0 72,0

6,1 85,0 15,0 7,3 23,0 77,0

6,2 81,5 18,5 7,4 19,0 81,0

6,3 77,5 22,5 7,5 16,0 84,0

6,4 73,5 26,5 7,6 13,0 87,0

6,5 68,5 31,5 7,7 10,5 90,5

6,6 62,5 37,5 7,8 8,5 91,5

6,7 56,5 43,5 7,9 7,0 93,0

6,8 51,0 49,0 8,0 5,3 94,7

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Adams С. W. М. (19S6). A stricter interpretation of the ferric ferricyanide reaction with particular reference to. the demonstration of protein-bound sulfhydryl and disulfide groups, J. Histochem. Cytochem., 4, 23—35.

Adams C. W. M., Sloper J'. C. (1956). The hypothalamic elaboration of posterior pituitary principles in man, the rat and doe. Histochemical evidence derived from a performic acid akaan blue reaction for cystine, J. Endoc-rin., 13, 221—228.

Adams C. W. M. (1957). A p-dimethylammobenzaldehyde-nitrite method for the histochemical demonstration of tryptophane and related compounds, J. Clin. Path, 10, 56—62.

Adams C. W. M. (1961). A perchloric acid-naphthoquinone method for the histochemical localization of cholesterol, Nature (Lond.), 192, 331—332.

Andersen H.,Hoyer P. ?. (1973). Studies in Succinate Dehydrogenase Histochemistry, Histochemie, 35, 173—188.

Arnold M.. 19681 Histochemie. Einfuhrung in Grundlagen und Prinzipien der Methoden, Sprinjrer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York.

ArzacJ. P., EloresL. G. (1949). The histochemical demonstration of glycogen by silver complexes. Stain Technol., 24, 25.

Axelsson St., Bjdrkhind A., Falck В., Lindvall 0, Svensson L.A. (1973). Gly-oxylic acid condensation: A new fluorescent method for the histochemical demonstration of biogenic monoamines, Acta physiol. scand, 87, 57—62.

Axelsson St., Bjdrkhind A., Lindvall O. (1972). Fluorescence histochemistry of biogenic monoamines: A study of the capacity of various carbonyl compounds to form fluorophores with biogenic monoamines in gas phase reactions, J. Histochem. Cytochem, 20, 435—444 (1972).

Bacchus H. (1950). Amer. J. Physiol, 163, 326.

Bachmann R., Seitz H. M. (1961). Zum histochemischen Nachweis des Histi-din mit Diazoniumsalzen, Histochemie, 2, 307—314.

Baker J.R. (1947). The histochemical recognition of certain guanidine deriva-tes, Quart. J. Micr. Sci, 88, 115—121.

Baker J.R. (1956). Histochemical recognition of phenols, especially tyrosine, Quart. J. Micr. Sci, 97, 161—164.

Barka Т., Anderson P. J., 1964. Histochemistry. Theory, Practice and Bibliography, Harper and Row, Pablishers, Inc, New York, Evanston and London.

Bamett S.A., Bourne G, Fisher R.B. (1941). Nature (Lond.), 147, 542. Barmen R.J., Seligman A.M. (1952). Histochemical demonstration of protein bound sulfhydryl groups, Science, 116, 323—327.

324 Список литературы

Barmen R.J., Seligman A.M. (1953). Investigation of the histochemical localization of disulfides, J. Histochem,. 1, 392—398.

Barrnett R. J., Seligman A. M. (1954). Histochemical demonstration fo sulfhy-dryl and disulfide groups of protein, J. Nat. Cancer Inst, 14, 769—803.

Barrnett R. J., Seligman A. M. (1958). Histochemical demonstration of pro-teinbound alpha-acyl-amido carboxyl groups, J. Biophys. Biochem. Cy-tol, 4, 169.

Bauer H. (1933). Mikroskopisch-chemischer Nachweis von Glykogen und ei-

nigeri anderen Polysacchariden, Z. mikr.-anat. Forsch., 33, 143-160. Bello J. (1956). The specific esterification of carboxyl groups of gelatin with

methanol and thionylchloride, Biochem. Biophys.- Acta, 20, 426. Bennett H.S. (1951). The demonstration of thiol groups in certain tissues by

means of a new colored sulfhydryl reagent, Anat. Rec, 110, 231. Berenbaum M. C. (1958). The histochemist