Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

змерениях является выцветание продукта реакции, особенно в условиях высокой интенсивности освещения. Поэтому в каждом случае следует проверять, на протяжении какого времени интенсивность окрашивания продукта реакции остается стабильной при данных условиях освещения.

7.2. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ГИСТОХИМИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Количественный гистохимический анализ нуклеиновых кислот проводится с помощью следующих методов: 1) ультрафиолетовая микроспектрофотометрия (Caspersson, 1950; Sandritter) для исследования РНК и ДНК; 2) реакции окрашивания: по Фёльгену (для ДНК) и основными красителями.

Поскольку исследование нуклеиновых кислот в ультрафиолетовом свете требует сложной аппаратуры, в последние годы все чаще используют стандартизованные реакции окрашивания в сочетании с цитофотометрией. Так как классическая реакция Фёльгена недостаточно воспроизводима (Sandritter), на первый план выдвигаются методы выявления фосфатных групп нуклеиновых кислот с помощью основных красителей.

7.2.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ МИКРОСПЕКТРОФОТОМЕТРИИ

Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), несмотря на различие в составе азотистых оснований, имеют близкие ха-

312 7. Количественная гистохимия

рактерные спектры поглощения, лежащие в ультрафиолетовой области, с четко выраженным максимумом (260 нм). На этом их свойстве основан весьма чувствительный метод ультрафиолетовой микроспектрофотометрии, позволяющий с помощью сложной и дорогой аппаратуры (ультрафиолетовые цитофотометры) измерять содержание нуклеиновых кислот в клетках и тканях. Через срез ткани пропускают пучок ультрафиолетового света, интенсивность поглощения которого (спектры поглощения) регистрируется с помощью фотоэлемента и соответствующего усилителя. В то время как содержание ДНК в ядре определяется довольно легко, количественные измерения РНК сопряжены с возможностью целого ряда труднопреодолимых ошибок. Точное количественное определение РНК с помощью ультрафиолетовой цитофотометрии возможно при соблюдении двух условий:

1. Когда исследуемая ткань либо совсем не содержит ДНК, либо содержит ее в минимальном количестве.

2. Когда ДНК может быть полностью удалена из ткани так, чтобы в ткани оставалась лишь РНК, или когда о количестве РНК можно судить по ослаблению поглощения света после обработки рибонуклеазой. Неполное удаление . одной из двух нуклеиновых кислот в каждом случае ведет к искажению результатов.

Кроме того, следует считаться с возможностью смещения обеих нуклеиновых кислот, особенно при определении их содержания в ядре. И наконец, поглощение света белками в ультрафиолетовой области также может послужить источником ошибки, особенно при их высоком содержании. Поглощение ультрафиолетового света жирами и углеводами в большинстве тканей не играет никакой роли.

7.2.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДНК И РНК ПРИ ОКРАШИВАНИИ ОСНОВНЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ

Помимо количественного определения РНК по поглощению ультрафиолетового света имеют значение также методы выявления РНК по окрашиванию основными красителями. В основе такого окрашивания лежит полианионный характер нуклеиновых кислот и связывание ими

7. Количественная гистохимия 313

красителей главным образом за счет электростатических сил. Имеющиеся в ткани другие анионы можно исключить, уменьшив величину рН раствора красителя (примерно до 4). Количественное определение нуклеиновых кислот основано на стехиометрическом характере реакции связывания красителя с выявляемым веществом. Необходим строгий контроль за концентрацией красителя в растворе, а также за ионной силой и величиной рН раствора.

Под действием фиксации происходит высвобождение заряженных фосфатных групп, нейтрализованных в натив-ном состоянии; при этом количество фосфатных групп, выявляемых в исследуемой ткани, под действием соответствующей обработки повышается. Поскольку число высвобождаемых фосфатных групп зависит от используемого метода фиксации, при сравнительных исследованиях содержания РНК необходимо придерживаться стандартизованной методики фиксации и последующей обработки ткани.

Для количественного определения РНК подходящими оказались следующие красители: галлоцианин—хромовые KBacnbi(Einarson, Sandritter, 1963 ;Kiefer), метиленовый синий (Deitch ), крезиловый фиолетовый (Ritter, азур В (Flax, Hi-mes). Галлоцианин—хромовые квасцы обладают целым рядом важных преимуществ для фотометрического определения количества связанного красителя (Sandritter, 1963).

1. Краситель связывается с нуклеиновыми кислотами настолько прочно, что при последующем промывании препарата потерь красителя не наблюдается.

2. Краситель придает нуклеиновым кислотам ортохроматическую окраску, которая, согласно Эйнарсону (Einar-son, 1951), имеет высокую специфичность для обеих нуклеиновых кислот в зоне рН от 1,50 до 1,75 с оптимумом окрашивания 1,54. При этом увеличение продолжительности окрашивания по сравнению с общепринятой ведет лишь к незначительному росту количества связанного красителя. Однако галлоцианин—хромовые квасцы связываются с фосфатными группами нуклеиновых кислот не только за счет электростатических сил, что несколько ограничивает ценность этого метода для количественной оценки содержания нуклеиновых кислот.

В настоящее время реакции окрашивания являются на-

12-235

314 7. Количественная гистохимия

илучшим методом количественной оценки содержания нуклеиновых кислот. Окрашивание метиленовым синим, азу-ром В и крез иловым фиолетовым не имеет каких-либо преимуществ по сравнению с окрашиванием галлоциани-ном—хромовыми квасцами. При окрашивании забуфе-ренным раствором метиленового синего в зависимости от фиксации и величины рН окрашивающего раствора можно проводить раздельные определения РНК и ДНК, что имеет значение для количественного анализа обеих нуклеиновых кислот. После фиксации клеток печени неполовозрелых мышей формалином (1:4) окрашивание ДНК наблюдается при рН 2,7, а РНК—при рН 3,1. После фиксации в жидкости Карнуа начало окрашивания ДНК наблюдалось при рН 3,8, а РНК—при рН 3,4 (v. Mayers-bach).

Результаты окрашивания основными красителями представляют ценность для количественного анализа лишь при условии проведения контрольных специфических экстракций нуклеазами или кислотным гидролизом. При этом необходимо следить за полнотой удаления соответствующей нуклеиновой кислоты. Для подтверждения цито-фотометрических измерений рекомендуется проводить предварительные биохимические исследования.

7.2.3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДНК ПО РЕАКЦИИ ФЁЛЬГЕНА

Фотометрическую оценку интенсивности реакции Фёльгена можно использовать для количественного определения ДНК в ядре при обязательной стандартизации условий фиксации, рН раствора, продолжительности и температуры гидролиза, качества реактива Шиффа и содержания S02 в воде. Важной предпосылкой надежности цитофотометрических данных является гомогенность распределения ядерного материала. Фиксирующие смеси, способствующие образованию грубых глыбок ядерного хроматина (например, такие кислые фиксирующие смеси, как спирт — уксусная кислота), непригодны.

Для количественного определения ДНК фотометриро-вание обычно проводят при длине волны, при которой поглощение света продуктом реакции Фёльгена максималь-

7. Количественная гистохимия 315

но. Максимум поглощения зависит от типа фиксации (560 нм при фиксации в Карнуа и 570 нм при фиксации в формалине). Поэтому при проведении измерений на незнакомом материале рекомендуется сначала снять спектр поглощения на одном или двух ядрах для установления длины волны, при которой следует проводить измерение. Этот же прием используется при анализе гидролиза нуклеиновых кислот.

В большинстве исследований содержание ДНК, определяемое с помощью цитофотометрических измерений, выражается в произвольных единицах. Измерение содержания ДНК осуществляется с помощью определения поглощения (экстинкции) в центральном участке клеточного ядра (метод зонда). Произвольные единицы вычисляются на основе данных по среднему оптическому поглощению и площади ядра с учетом поправки (2/3) на шаровидную или эллипсоидную форму ядра. Для вычисления абсолютных величин содержания ДНК необходимы сравнительные исследования на тканях, в которых содержание ДНК на ядро известно. Наиболее надежные результаты дает использование лиофилизированного материала.

7.3. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ГИСТОХИМИЯ БЕЛКОВ

Для количественного определения белков в клетках и тканях в первую очередь используются следующие методы:

1. Поглощение ультрафиолетового света.

2. Автофлуоресценция. "3. Интерферометрия.

4. Реакции окрашивания.

7.3.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПО ПОГЛОЩЕНИЮ В УЛЬТРАФИОЛЕТОВОМ СВЕТЕ

При цитофотометрическом определении содержания белка с помощью ультрафиолетового микроскопа используется область спектра от 230 до 300 нм, где находятся в первую очередь максимумы поглощения ароматических аминокислот, таких, как триптофан и тирозин. Отдифференцировать эти аминокислоты невозможно. Кроме того,

12»

316 7. Количественная гистохимия

следует учитывать возможность смещения максимума поглощения для белков за счет присутствия нуклеиновых кислот, а также за счет поглощения алифатическими аминокислотами. Определение положения и величины максимума поглощения для белков сопряжено поэтому с большими трудностями. Определение содержания белков с помощью ультрафиолетовой цитофотометрии сопряжено с большими ошибками, чем определение содержания нуклеиновых кислот.

7.3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ АВТОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Белки имеют характерные спектры флуоресценции в ультрафиолетовой и видимой области. Пропорциональность интенсивности флуоресценции при определенных условиях содержанию белка в клетках является теоретической предпосылкой возможности количественной оценки. Однако практическому применению этого метода мешают трудности дифференцирования отдельных белков и разграничения белков и ведущих себя сходным образом нуклеиновых кислот. Кроме того, такую же флуоресценцию дают связанные нуклеотиды (например, АТФ, АДФ).

7.3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ ИНТЕРФЕРОМЕТРИ

страница 48
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)