Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

срезом.

7. Промывка обработанного среза.

8. Исследование с помощью флуоресцентного микроскопа.

Из используемых красителей (флуорохромов) наиболее интенсивной флуоресценцией и стабильностью отличается изотиоцианат флуоресцеина. Дансил быстрее и легче связывается с белками. Использование диахромов для данного метода еще требует доработки. Высокая стабильность конъюгатов обеспечивается связыванием красителей с белками за счет главных валентностей.

Отдельные этапы, особенно п. 1—4, должны проводиться при строгом контроле. Специфичность реакции достигается при соблюдении следующих условий:

а) Выявляемый белок должен обладать антитенностью и иммуногенностью и иметь высокую степень иммунологической чистоты.

б) В качестве антигена нельзя использовать гетерогенную смесь белков, поскольку в этом случае на срезе можно получить смешанное окрашивание.

в) Антигенный характер выявляемого белка не должен изменяться в процессе обработки. «¦

г) Флуорохромы, используемые для конъюгации, не должны изменять свойств антител (например, их способности к преципитации).

При применении метода иммунофлуоресценции результат должен быть подтвержден контрольной пробой на специфичность. Сравнительно надежна в этом отношении реакция торможения: флуоресцентное окрашивание подавляется после предварительной обработки среза не-конъюгированной специфической антисывороткой; обработка неиммунной сывороткой не приводит к торможению.

Метод предполагает наличие определенных иммунологических навыков. При использовании иммуногистохими-ческих методов гистохимику рекомендуется обращаться за помощью к иммунологам, поскольку иммуногистохими-ческие методы относятся к наиболее сложным.

При использовании для иммунизации неочищенного антигена в антисыворотке образуются дополнительные лишние антитела иной специфичности, которые симули-

_6. Иммуногистохимия 299

руют высокий титр специфических антител и искажают реакцию выявления антигена.

6.1. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА АНТИГЕН - А1ГГИТЕЛО С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО МИКРОСКОПА

6.1.1. ПРЯМАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ АНТИГЕНА

Этот сравнительно простой метод состоит в нанесении меченых антител непосредственно на срез. При этом происходит специфическое связывание с антигеном. После отмывания антител, не вступивших в реакцию, препарат исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа (рис 12,Л).

Рис* 12. Прямая (А) и непрямая (Б) локализация антигена (по схеме Junqueira et al., 1975).

Объяснения в тексте.

6.1.2. ПРЯМАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ АНТИТЕЛ

Этот метод сводится к локализации антител путем прямого связывания с флуоресцирующим антигеном.

6.1.3. «СЭНДВИЧ»-МЕТОД

Серологически активные слои используют при непрямом выявлении антител и антигенов: Решающее преиму-

300 6. И мм уногистохимия

щество этого метода заключается в повышении чувствительности реакции и в более интенсивной флуоресценции. С помощью непрямого метода можно выявлять минимальные количества антигенов, поскольку в данном методе в отличие от прямого каждое антитело способно связывать несколько молекул флуоресцирующего анти-у-гло-булина (рис. 12,2>).

При непрямом выявлении антител клетка, содержащая антитела, связывает антигены, которые в свою очередь вновь связывают антитела.

Для непрямого выявления антигена необходимы две различные антисыворотки—одна немеченая и одна меченая. Немеченые антитела сначала связываются с антигеном. На втором этапе связанные антитела выявляются с помощью меченого анти-у-глобулина (рис. 12,15).

6.1.4. МЕТОДЫ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПЛЕМЕНТА

Эти методы представляют собой дальнейшее развитие «сэндвич»-метода. Создав условия для связывания комплемента с комплексом антиген—антитело* выявляют затем

mm

<3>

Рис. 13. Схема метода с использованием комплемента для непрямого выявления антигенов.

Л. по Гольдаассеру и Шепарду. Б. По Саччи в сотр. Антиген (....); антитело (хнх); комплемент (----); антикомплемеят (+ + + +). Стрелка—метка флуоресцентным красителем.

этот комплемент с помощью соответствующих антител, меченных флуоресцентным красителем. Для выявления антигенов в клетке сначала создают условия для взаимодействия антител с комплементом, а затем комплемент, свя-

6. Иммуногистохимия 301

занный с комплексом антиген — антитело, выявляют с помощью антикомплемента с флуоресцентной меткой (рис. 13,Л).

6.2. ЭЛЕКТГОгШО-МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ИММУНОГИСТОХИМИЯ

Основной предпосылкой является маркирование антитела с образованием продукта реакции, обладающего высокой электронной плотностью. Для этой цели используют метки, дающие контраст, а именно ферритин, мелкие вирусы и тяжелые металлы—ртуть и уран. Кроме того, в качестве метки можно использовать ферменты.

6.2.1. МАРКИРОВАНИЕ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ И ФЕРРИТИНОМ

Маркирование антител железосодержащим белком, ферритином, проводится в два этапа (рис. 14). Образующийся на первом этапе комплекс диизоцианатферритин, связывается на последующем этапе с антителом. Из соединений диизоцианата, имеющих две функциональные

Яяишюг Ферритин

Ряс 14. Три различных метода идентификации специфических белков при помощи иммунопитохимии (Junqueira et al., 1975).

Л. Антитела метит флуоресцентным красителем ¦ после взаимодействии с антигеном исследуют при помовш флуоресцектпого микроскопа. S. Антитела метят пероксидазой, после реакция антиген—антитело приводится гистохимическое выявление пероксидазы; конечный продукт гистохимической реакция исследуют при помела светового ила электронного микроскопа. В. Антитело метят с ферритином, кове<аый продукт реакции аитяген—антитело исследуют при помощи светового микроскопа.

302 6. Иммуногистохимия

группы (.м-ксилолдиизоцианат, толуол-2,4-диизоцианат), толуол-2,4-диизоцианат образует исключительно кова-лентные связи. Поэтому он является более пригодным, чем л«-ксилолдиизоцианат не обладающий подобными свойствами. Кроме того, конъюгацию антитела с ферритином можно проводить при участии дисульфонат-п,п-дифтор-м,м -динитрофенилсульфона, а также глутаральдегида. Маркирование соединениями ртути, которое может осуществляться опосредованно через диазотирование и сочетание, ведет к слабой реакции, локализацию которой не всегда легко установить. К тому же возможно неспецифическое окрашивание за счет взаимодействия ртути, например, с SH-группами.

Хорошей меткой могут служить ионы уранила, обеспечивающие контрастирование антител на месте их истинной локализации. Успешное введение метки, осуществляемое в три этапа, зависит от присутствия соответствующего антигена, предотвращающего нежелательное воздействие на места связывания антител.

6.2.2. МАРКИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТОМ

Для маркирования антител можно использовать целый ряд гидролитических и окислительных ферментов. Очень хорошие результаты дает маркирование пероксидазой хрена (рис. 14,15).

После реакции антиген — антитело локализацию антигена устанавливают по активности связанного фермента. Использование пероксидазы в качестве ферментной метки имеет два решающих преимущества: 1) фермент выпускается промышленностью в сравнительно чистом виде; 2) для его выявления разработаны надежные гистохимические методы на световом и электронно-микроскопическом уровнях. Успех реакции определяется высокой удельной активностью антитела и чистотой ферментного препарата. Для конъюгации антител с ферментом используют различные реагенты. Помимо функционального реагента—и, п'-дифтор-л<^м'-динитродифенилсульфона, который не оказывает существенного воздействия ни на ферментативную, ни на иммунологическую активность, важное значение, по-видимому, имеет также глутаральдегид, поскольку и он не

6. Иммуногистохимия 303

оказывает нежелательного воздействия на эти виды активности. По методу Накане и Пирса (Nakane, Pierce, 1967) антитела, меченные пероксидазой, вводятся в реакцию с соответствующими антигенами на срезах ткани или на ультратонких срезах. Связанный фермент затем выявляется при световой или электронной микроскопии с помощью метода Грэхема и Карновского (Graham, Karnovsky); в качестве субстратов используют диаминобензидин (ДАБ) и Н202. Маркирование пероксидазой благодаря стабильности и четкой локализации хорошо окрашенного продукта реакции во многих случаях оказывается предпочтительнее методов флуоресцентной метки.

Для ультраструктурной локализации антигенов Накане (Nakane) разработал 3 различных, непрямых иммуногисто-химических метода: а) выявление антигена на толстых срезах; б) выявление антигена на ультратонких срезах; в) выявление антигена на тонких срезах ткани, залитой в полиэтиленгликоль.

Чувствительность реакции может быть повышена за счет использования мультиреактивности иммуноглобулинов в процессе связывания молекул фермента на месте локализации антигена в ткани. Для этой цели служит так называемый «мостиковый» метод связывания иммуноглобулина с ферментом..

Для проведения этой реакции на тканевых срезах требуются следующие сыворотки:

а) специфическая антисыворотка против выявляемого антигена;

б) антисыворотка против у-глобулина животного, использованного для получения упомянутой антисыворотки (например, овечья антисыворотка против кроличьего у-глобулина);

в) специфическая антисыворотка против фермента-метки;

г) фермент-метка (лучше всего пероксидаза).

Для установления локализации антигена на ультратонких срезах используются следующие приемы:

1. Кусочки ткани фиксируют, обезвоживают, заливают в метакрилат или эпон.

2. Ультратонкие срезы ткани,, залитой в метакрилат, обрабатывают водой, насыщенной ксилолом, а срезы ткани, залитой в эпон, обрабатывают 10% Н202.

304 6. Иммуногистохимия

3. Ультратонкие срезы на сеточках помещают на каплю специфической антисыворотки кролика и затем промывают раствором хлорида натрия в фосфатном буфере.

4. Срезы помещают на каплю антисыворотки овцы против кроличьего у-глобулина, конъюгированного с комплексом пероксидаза-антипероксидаза.

5. Пероксидазная реакция проводится с 4-хлор-1-наф-толом или Н202 в качестве субстрата.

В результате антигены маркируются электроно-плотны

страница 46
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.08.2019)