|
|
Основы гистохимииствии Fe (ПТ) к образованию нерастворимого комплекса берлинской лазури. МЕТОДИКА 1. Фиксация формальдегидом, заливка в парафин (замороженные срезы менее пригодны). 2. Депарафинированные срезы довести до дистиллированной воды. 3. Срезы поместить в свежеприготовленный раствор, состоящий из равных частей 2%-ного гексацианоферрата (II) калия и 2%-ной соляной кислоты, в течение 30—60 мин (новый раствор использовать спустя 30 мин). __4. Промывка в дистиллированной воде. 5. В случае необходимости окрасить ядра ядерным прочным красным; после этого промыть дистиллированной водой. 6. Ряд спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам. РЕЗУЛЬТАТ Соединения железа (ИТ) окрашиваются в темно-синий цвет. 272 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов ПРИМЕЧАНИЯ Следует избегать контакта срезов с приборами, содержащими железо. Возможно проведение контрольной реакции с экстракцией железа. в) Выявление кальция, модификация по Мак-Ги—Расселу (McGee—Russel) ПРИНЦИП Отложения кальция с ализарином S в зависимости от рН образуют окрашенный комплекс МЕТОДИКА 1. Фиксация в формалине или в формалин—этаноле, заливка в парафин (кислые или металлосодержащие фиксирующие смеси менее пригодны). 2. Депарафинированные срезы поместить в 50%-ный этанол. 3. Быстро промыть в дистиллированной воде. 4. Под контролем микроскопии окрашивание ализариновым красным S (в 2%-ный раствор алийаринбвого красного S добавляют слабый раствор аммиака (1: L00), доводя рН до 4,1—4,3), 30 с—5 мин. 5. Срезы без промывки подсушить фильтровальной бумагой. 6. Поместить срезы в абсолютный ацетон на 10—20 с 7. Ацетон — ксилол (1:1), 10—20 с. 8. Ксилол, заключение в бальзам. РЕЗУЛЬТАТ Отложения кальция окрашиваются в оранжево-красный цвет (двойное лучепреломление); остальные структуры окрашиваются в розовый цвет. ПРИМЕЧАНИЕ При изменении рН могут окрашиваться другие неорганические соединения. 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов ПЪ г) Выявление калия по Крауту и Дженнингсу (Crout, Jennings) ПРИНЦИП Калий, находящийся в тканях, осаждается нитритом кобальта. МЕТОДИКА 1. Замораживание—высушивание, заливка в парафин. 2. Лиофилизированные парафиновые срезы толщиной 10 мкм переносят для депарафинирования непосредственно в петролейный эфир (срезы к предметному стеклу не прикреплять!). 3. Свободноплавающие срезы поместить в новую смену петролейного эфира. 4. Срезы прикрепить к предметному стеклу (без покрытия стекол белком с глицерином) и высушить на воздухе, после чего прижать их слегка фильтровальной бумагой. 5. Обработать раствором нитрита кобальта, охлажденным на льду, 15 мин. (Раствор -нитрита кобальта: 25 г нитрита кобальта растворить в 7 мл воды, добавить 12,5 мл уксусной кислоты; 120 г нитрита натрия растворить в 180 мл дистиллированной воды; к раствору нитрита кобальта в уксусной кислоте добавить 210 мл раствора нитрита натрия. Смесь оставить на воздухе 1—2 ч для удаления N02, охладить в холодильнике и отфильтровать перед употреблением на холоду.) *"6. Просушить фильтровальной бумагой, промыть в трех сменах дистиллированной воды, охлажденной на льду, по 15 с (пока не перестанут отделяться желтоватые облачка красителя). 7. Серия спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам. РЕЗУЛЬТАТ Нитрит калия — кобальта выпадает в осадок в виде желтовато-коричневых кристаллов. 274 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов ПРИМЕЧАНИЕ Реакция имеет достаточную специфичность, но следует считаться с возможностью смещения продукта реакции. д) Выявление тяжелых металлов с сульфидом серебра по Тимму (Timm) ПРИНЦИП В результате обработки раствором, содержащим H2S, происходит образование труднорастворимых аргиро-фильных сульфидов тяжелых металлов, на которых происходит осаждение серебра из восстанавливающей среды, содержащей нитрат серебра. МЕТОДИКА Необходимые растворы: а) Раствор гуммиарабика: 20 или 40 г неизмельченного гуммиарабика растворить в 100 мл дистиллированной воды, оставив раствор стоять 7—14 дней, (100, мл). б) 10%-ный водный раствор нитрата серебра; свежеприготовленный! (1 мл). в) Восстанавливающая среда.' 5 г лимонной кислоты и 2 г гидрохинона растворить в 100 мл бидистиллированной воды (10 мл). Растворы а, б и в (проявляющий раствор) смешать непосредственно перед употреблением. 1. Фиксация маленьких кусочков ткани в 70%-ном этаноле, насыщенном H2S (добавить 2 капли концентрированного аммиака к 100 мл) 10—12 ч; заливка в парафин. 2. Срезы, толщиной 6—8 мкм, прикрепленные к предметным стеклам (без приклеивающего вещества) довести через ксилол и ряд спиртов убывающей концентрации до дистиллированной воды. 3. Срезы, прикрепленные к предметным стеклам, помещают в плоские чашки, осторожно заливают проявляющей средой и проявляют в темноте при + 20°С до тех пор, пока срезы не приобретут светло-коричневый цвет, от 20 до 60 мин, максимально 6 ч. 4. Промыть в дистиллированной воде. 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 275 5. Докраска ядер ядерным прочным красным или гемалау-ном. 6. Промыть в дистиллированной и проточной воде. 7. Серия спиртов, ксилол, бальзам. РЕЗУЛЬТАТ Тяжелые металлы (Pb, Pt, Au, Ag, Fe, Cd, Cu, Co, Ni, Zn, Hg) окрашиваются в темно-коричневый цвет. Ядра окрашиваются в синий (гемалаун) или в красный (ядерный про чный красный) цвет. ПРИМЕЧАНИЯ Специфичность реакции можно повысить, используя контроли. Образование осадка в процессе окрашивания можно ослабить путем использования бидистиллирован-ной воды в кварцевом стекле. е) Метод с сульфидом серебра для криостатных срезов по Брунку и Шельду (Brunk, Skold) МЕТОДИКА 1. Из свежей ткани вырезать тонкие кусочки (максимальная толщина 2 мм). 2. Кусочки ткани обработать во влажной камере при температуре + 20°С парами H2S, 20 мин. 3. Криостатные срезы толщиной 6—8 мкм прикрепить на,лредметные стекла. 4. Дальнейшая обработка по стандартному методу Тимма (п. 3, проявление срезов). ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ НАТРИЯ И ХЛОРА а) Электронно-микроскопическое выявление натрия по Комнику (цит. по Geyer, 1973) ПРИНЦИП Ионы Na+ осаждаются гексаоксиантимонатом калия 276 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов K[Sb(OH)6], с которым они дают нерастворимый осадок: K[Sb(OH)6] + Na+ Na[Sb(OH)6] + К+ . МЕТОДИКА Фиксация очень маленьких кусочков ткани в 1% Os04 с 2%-ным раствором K[Sb(OH)6] при постоянном встряхивании при +1° С, от 60 до 90 мин. Фиксирующий раствор: гексаоксиантимонат калия растворить в дистиллированной воде на водяной бане и после охлаждения добавить Os04. рН раствора довести 0,01 н. уксусной кислотой до 7,2—7,4. 2. Кусочки ткани без предварительной промывки провести через ряд ацетонов (10, 30, 50 и 70% по 5 мин), затем провести через 90%-ный ацетон (10 мин) и через 3 смены абсолютного ацетона (по 10 мин). Для контрастирования в 70%-ный ацетон добавляют 1%-ную. фосфовольфрамо-вую кислоту и 0,5%-ный уранилацетат. 3. Заливка в эпоксидные смолы или полиэфиры. РЕЗУЛЬТАТ Продукт осаждения—Na[Sb(OH)6] дает отчетливый контраст. ПРИМЕЧАНИЕ Следует учитывать, что, помимо натрия, гексаоксиан-тимонатом калия могут осаждаться и ионы других металлов (например, Са, Mg, Ва, Zn, Fe) и некоторые амины (гистамин, спермин). б) Электронно-микроскопическое выявление хлора по Ком-нику (цит. по Geyer, 1973) ПРИНЦИП Хлор осаждается ионами Ag + (ацетатом или лактатом 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 277 серебра) в виде нерастворимого осадка: СН3СНОНCOOAg + СГ -* AgCl + СН3СНОНСОО" . МЕТОДИКА 1. Фиксировать маленькие кусочки ткани, постоянно помешивая (+ 1°С) в темноте или при слабом красном свете, 2 ч. Фиксирующая смесь: 1,5% Os04, а также 1%-ный лактат серебра в 0,05—0,1 М какодилат-уксусном буфере, рН 6,4—6,6. 2. Кусочки ткани поместить в темноте или при слабом красном свете в 10%-ный и 30%-ный ацетон по 5 мин. 3. Дифференцировать в 0,1 н. HN03 в 50%-ном ацетоне—2 смены по 5 мин. 4. Обезводить в 2 сменах (70%-ном и 90%-ном) ацетона по 5 мин и в 3 «Менах абсолютного ацетона по 10 мин. 5. Заливка в эпоксидные смолы и полиэфиры. РЕЗУЛЬТАТ Хлорид серебра выпадает в виде электроноплотного, мелкозернистого осадка. ПРИМЕЧАНИЕ Возможные артефакты диффузии осложняют выявление связи между наблюдаемым осадком и истинным распределением ионов in vivo. 5. РАДИОАВТОГРАФИЯ Радиоавтография позволяет устанавливать локализацию радиоактивных веществ в клетках и тканях благодаря действию излучения на фотографическую эмульсию. Содержащиеся в эмульсии кристаллы бромида серебра выполняют роль микродетекторов радиоактивности. Радиоавтография, которую в применении к исследованию локализации радиоактивности в тканях называют иногда гисторадиоавтографией, может дать ответ на следующие вопросы: 1. Где локализуется радиоактивность в данном объекте? 2. Сколько радиоактивного вещества содержится в объекте? , 3. В каких веществах находится метка? Кроме того, радиоавтография позволяет наблюдатв обмен веществ до уровня отдельных клеток и субклеточных структур и определять интенсивность их обновления. Благодаря этому радиоавтография является прекрасным дополнением гистохимии. Особенно ценные сведения по обменным процессам дает комбинированное использование гистохимии и радиоавтографии. 5.1. ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ Первые радиоавтографические исследования были проведены в 1924 г. на ткани почек с естественным радиоактивным элементом полонием-210. Однако свое подлинное место радиоавтографические методы завоевали лишь с открытием искусственной радиоактивности. Различные изотопы химических элементов могут быть стабильными и нестабильными. Распад нестабильных изо- 5. Радиоавтография 279 топов сопровождается выделением энергии в форме радиоактивного излучения. Процесс радиоактивного излучения характеризуется периодом полураспада—временем, в течение которого распадается половина всей имеющейся массы радиоактивного изотопа. Для каждого радиоактивного изотопа характерен сво |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 |
Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |