Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

лжительность замещения в замороженном состоянии зависит от выбора растворителя и температуры, при которой оно проводится. Последующая заливка в парафин или другую среду происходит при более высоких температурах. Для предотвращения нарушения структуры в результате резкого перехода из холодной среды в теплую объект помещают в 75%-ный спирт при температуре, при которой проводится замещение (от; — 20 до — 50° С), и затем постепенно повышают температуру до комнатной. После этого проводится обычное обезвоживание через абсолютный этанол и заливка в парафин.

При постоянных условиях результаты замещения в замороженном состоянии, проведенного в соответствии с указаниями, приведенными в табл. 2, могут считаться удовлетворительными. Трудности иногда возникают из-за слишком высокой температуры при замещении или из-за образования кристаллов льда при замораживании.

Преимущество замещения в замороженном состоянии перед замораживанием—высушиванием заключается в его простоте. Недостаток же метода замещения в замороженном состоянии в первую очередь заключается в том, что он по своей природе представляет собой химическую (хотя и очень мягкую) фиксацию, которая при температурах около — 80°С практически прекращается или же протекает очень медленно. Кроме того, возможности метода ограничены тем, что для высушивания и фиксации применимы лишь такие среды, которые остаются жидкими при низких температурах. Метод замещения в замороженном состоянии обеспечивает прекрасную сохранность гликоге-

2. Методы гистохимии 23

Таблица 2

Возможности применения различных методов замещения в замороженном состоянии

Замещающая жидкость Метод Время обезвоживания и температура, °С Достижимая цель

Этанол Woods, 6 дней, от —41 Сохранение

Pollister (1955) до -45° белков в минимально денатурированной форме

Метанол Rebhun, Gagne (1962) 6 дней, -108° Хорошая сохранность структуры

Ацетон

Осмирован- Feder,

ный ацетон Sidman (1958) 6 дней, -70°

Осмирован-

ный HgCl2-

ацетон

Смесь Рос-

смана Peyrot (1956) 6 дней, —60° Сохранение гликогена

Этанол 6 дней, -50° Фиксация 1—3 дня Стабилизация сульфгид-рильных

прн -50° групп, связанных с бел-

2,5%-ным

раствором ками

трихлор-

уксусной

кислоты

в этаноле

Ацетон Davis et al. 6 дней, -50° Выявление эсте-

(1959) Фиксация 1—3 дня разной активности при хо-

при -50° 1%-ным рошей со-

хранности

раствором структуры

Os04 в аце-

тоне

на и клеточных органелл, например митохондрий. Потери вещества в процессе замещения также незначительны. При использовании метанола в качестве замещающей жидкости отмечены значительные потери N и Р, в то время как

24 2. Методы гистохимии

при использовании ацетона потери N и Р весьма незначительны.

Что касается экстракции липидов, то с ней приходится считаться, особенно при повышении температуры, следующем за фазой замещения в замороженном состоянии. Стабилизации митохондриальных и других липидов способствует добавление в замещающую жидкость солей металлов. Наилучшие результаты при этом были получены с использованием уранилнитрата вместе с хлоралгидратом.

Кроме того, метод замещения в замороженном состоянии применим для выявления целого ряда гидролитических и окислительных ферментов, таких, как щелочная и кислая фосфатаза, АТФаза, 5 -нуклеотидаза, аминопепти-даза, а также различных дегидрогеназ и диафораз (табл. 3).

Таблица 3

Сохранность фермевтатимой активности в тканях при замещении

ацетоном

Фермент АТФаза Кислая фосфатаза Щелочная фосфатаза 5'-нуклео-тидаза > Сукцн-натдегид-рогсиаза

Доля активности, % 70 76 92 95 75

Предшествующий опыт свидетельствует о том, что метод замещения в замороженном состоянии обеспечивает стабилизацию структуры тканей, особенно в сочетании с подходящей фиксацией. Очень,хорошими фиксаторами оказались четырехокись осмия и хлорид ртути (табл. 2). Метод замещения в замороженном состоянии, обеспечивающий прекрасную сохранность гликогена (табл. 2), можно рекомендовать также для выявления углеводов, белков и нуклеиновых кислот. Сульфгидрильные группы, связанные с белками, лучше всего выявляются после фиксации в 2,5%-ной трихлоруксусной кислоте в 95%-ном этаноле. Этот метод дает также хорошие результаты при выявлении неорганических веществ и ферментов. Весьма успешной оказалась фиксация при низкой температуре, которую можно проводить сразу же вслед за замещением

2. Методы гистохимии 25

в замороженном состоянии. Однако возможности этого метода для электронной микроскопии еще недостаточно изучены.

2.1.3. ПОЛУЧЕНИЕ ЗАМОРОЖЕННЫХ СРЕЗОВ

При этом методе объекты приобретают необходимую для резки консистенцию благодаря превращению содержащейся в тканях воды в лед. Для сохранения структуры решающее значение имеет быстрое замораживание, поскольку от этого зависит характер образования кристаллов льда.

Замораживание осуществляется, как правило, за счет поглощения тепла в процессе испарения жидкой углекислоты, выпускаемой из баллона через небольшое отверстие. От загрязнений или остатков воды при использовании нового баллона с углекислотой удается избавиться резким выпусканием нескольких порций углекислоты.

Приготовление замороженных срезов примерно одинаковой толщины возможно лишь при условии дополнительного охлаждения ножа с помощью специального подвода углекислоты. Скрученные или расправленные срезы с охлажденного ножа переносят непосредственно в инкубационную или фиксирующую среду, или в дистиллированную воду, или же монтируют на предметных стеклах. Непосредственно перенести с ножа на предметное стекло можно лишь такие срезы, которые расправлены на ноже. В жидкости, применяемой при дальнейшей обработке, срезы иногда распадаю ся на мелкие фрагменты за счет поверхностного натяжения среды. Этому процессу можно воспрепятствовать, добавив к инкубационной среде 7,5% поливинилпирролидона и 1—2 капли Твина 20 или 40.

Криотомия требует определенных навыков в работе. Соответствующий опыт позволяет регулярно получать срезы хорошего качества. Правда, при высокой температуре и влажности воздуха в помещении неизбежно возникают трудности. Подобная зависимость резки от внешних факторов является существенным недостатком. Последний можно устранить, если готовить срезы в холодной комнате или поместить замораживающий микротом в хо-

26 2. Методы гистохимии

лодильную камеру. Для этой цели годится обычный холодильник.

Качество срезов в значительной мере зависит от консистенции объекта; она, как правило, должна быть мягче той, при которой замороженный материал становится хрупким. Но даже при оптимальной консистенции следует считаться с тем, что срезы различаются по толщине. Это является следствием недостаточного контроля за температурой ткани и раздельного охлаждения ножа и объекта, так что приготовление серийных срезов на замораживающем микротоме невозможно.

Чтобы свести к минимуму влияние внешних факторов, в конструкцию замораживающего микротома был внесен целый ряд модификаций. Важнейшая из них заключается в том, что материал и бритва постоянно охлаждаются сухим льдом, а срезы с помощью специальной насадки переносятся сразу в инкубационную или фиксирующую смесь (ацетон, этанол, формол-этанол). Однако даже эти приспособления не предохраняют полностью от атмосферных воздействий.

Все эти недостатки метода получения замороженных срезов с помощью охлажденного ножа в*знач1гТельной мере устраняются при использовании криостата.

2.1.4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КРИОСТАТА

Этот метод был разработан Линдерштрём-Лангом (Linderstrom-Lang) и является по существу усовершенствованием метода получения срезов с помощью охлажденного ножа. Резка объекта проводится в термически изолированной камере с низкой, регулируемой температурой (от — 10 до — 30°С). Это предотвращает оттаивание срезов с последующим нарушением структуры. Постоянные условия приготовления срезов позволяют получать серийные срезы различной толщины и различной площади. В специальных криостатах можно также получать срезы с целого лабораторного животного, что в сочетании с радиоавтографией дает весьма ценные результаты.

Преимущество криостата в первую очередь заключается в возможности получения серийных срезов нативного материала для энзимогистохимических исследований.

2. Методы, гистохимии 27

Обычно получают срезы толщиной 10—40 мкм, но, используя рекомендованное Пирсом приспособление для глубокого охлаждения ножа (от — 30 до — 60°С), можно для специальных исследований получать срезы толщиной до 3 мкм. Для энзимогистохимических исследований необходимо наличие большого числа интактных клеток в срезе, поэтому толщина срезов должна быть от 30 до 40 мкм.

Существует два основных типа криостатов. В первом типе управление осуществляется снаружи через два боковых отверстия при закрытом криостате. Во втором— управление ведется при снятой крышке криостата. В современных криостатах такого типа при открытой крышке над микротомом создается воздушная прослойка с установленной температурой, так что даже при высокой температуре и влажности воздуха в помещении условия для резки остаются идеальными. К этому следует добавить, что при удобном и легком управлении приготовление срезов с фиксированных объектов легче удается в криостатах открытого типа. В криостате "Cryo-Cut" резка осуществляется автоматически с помощью мотора.

Качество срезов находится в полной зависимости от температуры ткани и ножа; контроль за этими параметрами осуществляется с помощью термо-электрических датчиков.

Для приготовления криостатных срезов материал следует заморозить как можно быстрее, лучше всего на сухом льду, как при криотомии. Эту процедуру можно провести или начгканедержателе, или, еще лучше, в специальной замораживающей камере, прикрепляемой к контейнеру с углекислотой. Если для замораживания используется изо-пентан, охлажденный сухим льдом или жидким азотом, то к

страница 4
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.06.2019)