|
|
Основы гистохимииПО ЛИЛЛИ (LILLIE) МЕТОДИКА 1. Фиксация в различных смесях, заливка в парафин. 4. Гистохимия отдельных классов вещеицв и ферментов 251 2. Депарафинированные срезы довести до воды. 3. Поместить в 2,5%-ный раствор сульфата железа, 60 мин. 4. Промыть в 4 сменах дистиллированной воды, по 5 мин. 5. Поместить в 1%-ный раствор гексацианоферрата (III) калия в 1%-ной уксусной кислоте, 30 мин. 6. Промыть в 1%-ной уксусной кислоте. 7. Провести через ряд спиртов возрастающей концентрации, ксилол, нейтральный бальзам. РЕЗУЛЬТАТ Меланин окрашивается в темно-зеленый цвет на бесцветном фоне. Такой же цвет имеет гемосидерин. ПРИМЕЧАНИЕ После п. 6 возможно докрашивание ядер. МЕТОД ЦИЛЯ - НИЛЬСЕНА (ZIEHL - NEELSEN) ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ ЛИПОФУСЦИНОВ МЕТОДИКА 1. Фиксация в различных смесях, заливка в парафин. 2. Депарафинированные срезы довести до дистиллированной воды. 3. Окрашивание срезов в раствоое карбол-фуксина при + 60°С, 3 ч (10 г основного фуксина, 50 г фенола, 100 мл этанола, 1000 мл дистиллированной воды). 4. Промывка в проточной воде. 5. Дифференцирование в 1%нной соляной кислоте в этаноле до тех пор, пока эритроциты станут розовыми. 6. Промывка в дистиллированной воде. 7. Докраска в железных квасцах или 0,5%-ном растворе толуидинового синего. 8. Промывка в проточной воде. 9. Обезвоживание в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам. 10* 252 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов РЕЗУЛЬТАТ Кислотоустойчивые липофусцины ярко-красного цвета, а липопротеиды—красноватого. Ядра окрашиваются в темно-синий или синий цвет. ПРИМЕЧАНИЕ Из-за базофилии липофусцина слишком сильная докра-ска ведет к развитию темно-красного окрашивания. ОКРАШИВАНИЕ НИЛЬСКИМ СИНИМ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ РАЗЛИЧИЙ МЕЖДУ МЕЛАНИНОМ И ЛИПОФУСЦИНОМ ПО ХУЭКУ (HUECK) МЕТОДИКА 1. Любая фиксация, заливка в парафин. 2. Депарафинированные срезы поместить в дистиллированную воду. ч 3. Срезы окрашивать свежеприготовленным насыщенным водным раствором нильского синего, 30 мин. 4. Промыть в дистиллированной воде. 5. Обесцветить 10%-ной перекисью водорода, 24 ч. 6. Промыть в проточной воде. 7. Заключить в глицерин — желатину. РЕЗУЛЬТАТ Липофусцин окрашивается в синий цвет, меланин не окрашивается. 4.7. БИОГЕННЫЕ АМИНЫ Термин «биогенные амины» охватывает физиологически и фармакологически важные низкомолекулярные органические основания, которые образуются в процессе обменных реакций в организме и находятся в тесной связи с белками и аминокислотами. Биогенные амины широко распространены в природе и встречаются как в животных, 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 253 так и в растительных тканях. Они играют важную физиологическую роль в передаче в нервной системе сигналов возбуждения и торможения (нейромедиаторы). 4.7.1. СВОЙСТВА, КЛАССИФИКАЦИЯ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ Биогенные амины образуются в процессе декарбоксилирования аминокислот. Важную роль при этом играют ферментативные системы. Ферменты, участвующие в метаболизме биогенных аминов, известны все без исключения. Аминокислота Биогенный амин Тирозин Тирам ин Гйстидин Гнетам ин ^ Триптофан Триптамин 5-окситриптофан Серотонин (5-окси- триптамин) Гистохимически важные биогенные амины: 5-окси-триптамин, триптамин, тирамин, адреналин, норадрена-лин и дофамин являются моноаминами. Их принято делить на 2 группы—катехол амины и индол амины. Катехоламины' являются производными аминокислоты тирозина, которая в свою очередь может образовываться из фенилаланина. Катехоламины, к которым принадлежат адреналин, норадреналин и дофамин, имеют катехиновое ядро (-диоксифенильную группу) (рис. 7). Индоламины образуются из аминокислоты триптофана или родственных ей продуктов, таких, как 5-окситриптофан. Их ядром является индольная группа. К индолами-нам принадлежит серотонин (5-окситриптамин). Концентрация биогенных аминов в большинстве органов, особенно в мозге, очень низка (табл. 45). Поэтому для их топохимического выявления в нервной системе пригодны лишь высокочувствительные реакции конденсации на лиофилизированной ткани мозга. В других тканях (например, в желудочно-кишечном тракте, мозговом веществе надпочечника) выявление этих активных веществ уже давно было осуществлено с помощью хромаффинных или аргентаффинных реакций. Из ряда доступных 254 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов н н I I C-C-MHi н соон н н I JksJ н с NH2 соон он н н I I с-с соон ЫНг Н Н но у ОН он Фенилаланин Тирозин C-C-NH2 Н Н I I с-с-мн2 онн ДОФА Доа>амин Норадреналин НО он н н I I C-C-NH „ I | I Адреналин ОНН СН3 Рис. 7. Схема образования катехоламинов из аминокислот (Schadej. Таблица 45 Концентрация биогенных аминов в неокортексе у собаки и кошки, иг/г__ Область мозга \цетилхолин Дофамин Норадреналин Серотонин Гистамин Неокортекс 2000 100 100 3Q0 100 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 255 гистохимическому выявлению биогенных аминов выпадает нейромедиатор ацетилхолин, для которого до сих пор не существует надежного гистохимического метода выявления. Разработка такого метода представляет собой важную задачу. Помимо центральной и периферической нервной системы биогенные амины встречаются в эпителии желудочно-кишечного тракта, в мозговом веществе надпочечника (клетки, вырабатывающие адреналин и норадреналин), в островковой ткани поджелудочной железы, в щитовидной железе, тимусе и в фабрициевой сумке у птиц, а также в других органах. В центральной и периферической нервной системе биогенные амины встречаются большей частью в синаптических пузырьках, причем в центральной нервной системе содержание этих медиаторов в разных ядрах различно. Ретикулярная формация и гипоталамус, например, отличаются высоким содержанием норадреналина, а область полосатого тела—очень низким. Дофамин локализуется главным образом в области бледного ядра (pallidum) и скорлупы (putamen). Особенно большие количества катехоламина выявляются в пост-ганглионарных симпатических нейронах. 4.7.2. ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ БИОГЕННЫХ АМИНОВ Для гистохимического выявления биогенных аминов разработаны следующие методы: 1) хромаффинная реакция; 2) аргентаффинная реакция; 3) реакция окрашивания; 4) реакция конденсации. Методы, используемые для выявления биогенных аминов в световой и электронной микроскопии, суммированы в табл. 46. 4.7.2.1. ХРОМАФФИННАЯ РЕАКЦИЯ В результате окислительного действия соединений, содержащих хром (например, бихромата калия), на целый 256 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов_ Таблица 46 Гистохимические методы выявления биогенных вминов (Hahn v. Dorsche u. Mitarb., 1975) Метод Световая Электронная Аминогруппа/ амии микроскопия микроскопия Конденсация с формальдеги- + Катехоламин дом серотонин Конденсация с глноксиловой + То же кислотой Конденсация с о-фтальальде- + Гнстамнн, се- гидом ротонин Хромаффннная реакция + + Катехоламин Аргентаффинная реакция + + Реакция с перманганатом + Реакция с нодом + Осаждение солью Райнеке + + Гнстамнн, ка- техоламин, серотонин Преципитация турнбулевой + Катехоламин сини Метод с солями тетразолия + »> Метод с диазосульфаниловой кислотой—азур А + »» Метод с п-броманилином + Метод с диазосафранином . + ряд биогенных аминов образуется коричневый пигмент: н Норадреналин Норадренохром Развитие коричневого окрашивания никак не связано с окрашивающим действием хромовых солей; оно появляется также и под действием других окислителей, не содержащих хрома, например иодата калия. Эту в общем неспецифическую реакцию можно превратить в специфическую особым типом фиксации. Так, с помощью глутаральдегида можно отделить первичные амины (норадреналин, окситриптамин) от вторичного амина—адреналина. Формальдегидная фиксация с последую- 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 257 щей хромаффинной реакцией ведет к окрашиванию серотонина, тогда как адреналин, норадреналин и дофамин не дают окрашивания. 4.7.2.2. АРГЕНАФФИННАЯ РЕАКЦИЯ Под аргенаффинностью понимают способность определенных структурных элементов восстанавливать аммиачный раствор серебра до металлического серебра без применения восстановителей. Процесс восстановления свидетельствует о наличии 5-окситриптамина (серотонина), норадреналина и дофамина. Адреналин дает отрицательную реакцию. Скорость восстановления серебра для разных аминов различна: норадреналин восстанавливает серебро за несколько секунд, дофамин примерно за 1 мин, а 5-окситриптамин—за 30 мин. На этом основании возможна дифференцировка 3 типов аминов. Для выявления аргентаффинности в световой микроскопии наиболее пригоден метод Массона—Гамперля (см. Romeis, 1948 или 1968). Для электронно-микроскопического выявления аргент-аффинных веществ рекомендуется метод Трамеццани, Киоккио и Вассерманна (см. Geyer, 1973). 4.7.2.3. РЕАКЦИИ ОКРАШИВАНИЯ Из этой категории следует упомянуть в первую очередь три метода: диазониевая реакция, индофенольная реакция и реакция Гибса. В диазониевой реакции (реакция диазосочетания) в щелочной среде выявляются фенольные производные с незамещенной гидроксильной группой. 4.7.2.4. МЕТОДЫ КОНДЕНСАЦИИ Перечисленные в табл. 46 методы конденсации, используемые для установления внутриклеточной локализации биогенных аминов, основаны главным образом на методе флуоресценции с формальдегидом по Фальку и Хилларпу (Falck, Hillarp), для которого можно использовать как парафиновый материал после замораживания — — высушивания, так и высушенные криостатные срезы. 258 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов_ При этом образуются флуорофоры, которые можно анализировать и подвергать количественной оценке с помощью микроспектрофлуориметрического анализ |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 |
Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |