Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

>МЕТОД G СОЛЬЮ СВИНЦА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТАЗЫ ПО ВАКСТАЙНУ И МАЙЗЕЛ (WACHSTEIN, MEISEL, 1956)

МЕТОДИКА

1. Кусочки ткани быстро заморозить и приготовить замороженные или криостатные срезы толщиной 10—4 5 мкм; нанести на предметное стекло и подсушивать, 1—2 мин.

2. Инкубация в течение 5—20 мин цри температуре от + 32 до +37°С в следующей среде:

0,125% глюкозо-6-фосфата (калиевая соль) 20 мл

0,2 М тршумалеатный буфер (рН 6,7) 20 мл

2%-ный нитрат свинца 3 мл

Дистиллированная вода 7 мл

3. Промывка в 4 сменах дистиллированной воды, всего 1 мин.

4. Обработка срезов в растворе сульфата аммония (0,5 — 1%), 5 мин. '

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 231

5. Фиксация срезов в 10%-ном растворе формальдегида, 60 МИН;

6. Промывка в нескольких сменах дистиллированной воды.

7. Срезы заключить под покровное стекло в глицерин-желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

Места ферментативной активности маркируются черным осадком сульфида свинца.

КОНТРОЛЬ

Инкубация без субстрата.

ПРИМЕЧАНИЯ

Даймлйнг (Deimling) рекомендует для выявления глю-козо-6-фссфатазы метод одновременного окрашивания солями тяжелых металлов в результате Образования комплексов свинца. В качестве комплексообразоваТеля используется бренцкатехин:3,5-дисульфанат (тирон). В качестве субстрата вместо калиевой соли используется легче доступная динатриевая соль глюкозо-6-фосфата.

ВЫЯВЛЕНИЕ ТИАМИНПИРОФОСФАТАЗЫ ПО НОВИКОВУ И ГОЛЬДФИ-HJEPy (fJOVIKOFF, GOLDFISCHER, 1961)

МЕТОДИКА

1. Нефиксированные замороженные или криостатные срезы, замороженные или криостатные срезы, постфикси-рованные в холодном кальций — формоле по Бейкеру (15 мин) промыть в дистиллированной воде.

2. Инкубация при + 37° С до 1 ч в следующей среде:

0,01 М тиаминпирофосфат 3,0 мл

Дистиллированная вода 1,2 мл

0,2 М шрис-малеатный буфер (рН 7,2) 6,0 мл

1% нитрат свинца 1,8 мл

0,025 М МпС12 3,0 мл

232 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

Медленное встряхивание во время инкубации создает более благоприятные условия для протекания реакции.

3. Срезы тщательно промыть в дистиллированной воде.

4. Обработать желтоватым раствором сульфида аммония. .

5. Промывка в дистиллированной воде.

6. Заключение в глицерин—желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

Положительная реакция (почти исключительно в аппарате Гольджи) выражается в выпадении черного осадка.

ВЫЯВЛЕНИЕ НУКЛЕОЗИДДИФОСФАТАЗЫ ПО НОВИКОВУ И ГОЛЬД-ФИШЕРУ (NOVIKOFF, GOLDFISCHER, 1961)

МЕТОДИКА

1. Свежие замороженные или криостатные срезы толщиной 10—15 мкм нанести на предметное стекло и фиксировать в холодном кальций — формоле, 10—15 мин.

2. Промывка срезов в дистиллированной воде.

3. Инкубация от 15 до 20 мин при +25°С иди +37° С в следующей среде:

4 мМ субстрат (лучше всего соль инозин-5-дифосфат-№э) 80 мМ mpuc-малеатный буфер (рН 7,0)

3,6 мМ нитрат свинца

5 мМ МпС12 или MgCl2

4. Срезы тщательно промыть в дистиллированной воде и затем поместить в раствор сульфида аммония на 1 мин.

5. Тщательно промыть в дистиллированной воде и заключить в глицерин — желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

Ферментативная активность маркируется осадком сульфида свинца, преимущественно в аппарате Гольджи.

ПРИМЕЧАНИЕ

Нуклеозиддифосфатаза вместе с тиаминпирофосфата-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 233

зой характерны для аппарата Гольджи, но встречаются и в эндоплазматическрм ретикулуме.

ВЫЯВЛЕНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭСТЕРАЗЫ ПО ДЭВИСУ И OPH-ШТЕЙНУ (DAVIS, ORNSTEIN, 1959)

МЕТОДИКА

1. Маленькие кусочки ткани фиксировать в кальций — — формоле по Бейкеру или в 2—3%-ном глутаральдегиде при +4°С; приготовить замороженные или криостатные срезы толщиной 10—15 мкм; нефиксированные замороженные или криостатные срезы дофиксировать этими же фиксаторами, 10—15 мин.

2. Срезы промыть в дистиллированной воде и инкубировать при комнатной температуре, 1—15 мин.

Инкубационная среда: 15 мг а-нафтил ацетата на водяной бане расплавить при температуре от + 50 до + 55°С при энергичном встряхивании (до помутнения), добавить 2—3 мл дистиллированной воды и довести объем ОД М Na2HP04 до 25 мл. К этому раствору добавить диазоти-рованный парарозанилин (8 капель 4%-ного парарозанилина в 2 н. НС1 + 8 капель 4%-ного NaN02 при помешивании на ледяной бане). рН инкубационной смеси доводится ОД М NaH2P04 от 8,0—8,5 до 7,0—7,1.

3. Срезы промыть в дистиллированной воде и заключить в глицерин — желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

Эстеразная активность проявляется красно-коричневым окрашиванием.

КОНТРОЛЬ

Инкубация без субстрата; предварительная инкубация с 10"5 или 10"3 МЕ600 (параоксон), после которой тщательно промыть в дистиллированной воде и провести инкубацию.

9-235

234 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ВЫЯВЛЕНИЕ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ С АЦЕТИЛХОЛИНИОДИДОМ ПО ГОМОРИ

МЕТОДИКА

1. Фиксация: холодный кальций — формол по Бейкеру, замороженные или криостатные срезы, дофиксированные в холодном кальций — формоле по Бейкеру (10—15 мин) с последующей тщательной промывкой в дистиллированной воде, или срезы нефиксированного материала.

2. Инкубация свободноплавающих срезов или срезов, прикрепленных на покровные или предметные стекла при + 37 С в Свежеприготовленном инкубационном растворе, 10—60 мин.

Приготовление инкубационного раствора: а) Маточный раствор

Сульфат меди (CuS04-5H20) 0,3 г Глицин , 0,375 г

Хлорид магния (MgCl2-6H20) 1,0 г

Малеиновая кислота 1,75 г

NaOH (4%) 30 мл

Na2S04 (40%, насыщенный при подо- 170 мл греве) рН 6,0 »

б) Инкубационный раствор: 20 мг ацетилтиохолинио-дида растворить в нескольких каплях дистиллированной воды и добавить 10 мл маточного раствора.

3. Промыть ъ-Ъ сменах насыщенного раствора Na2S04.

4. Поместить срезы в раствор сульфида аммония, 2 мин.

5. Быстро промыть в проточной и дистиллированной воде и заключить в глицерин — желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

Активность ацетилхолинэстеразы проявляется окрашиванием различных оттенков—от коричневого до черного.

КОНТРОЛЬ

Инкубация без субстрата; инкубация с 10 " 4 М эзери-ном (физостигминсалицилат) в инкубационной среде без

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 235

субстрата (предварительная инкубация) и в среде с субстратом (основная инкубация) для подавления ацетилхо-линэстеразной и холинэстеразной активности.

ПРИМЕЧАНИЯ

Реакция дает надежные результаты и пригодна как дл.. исследовательских целей, так и в практической работе. Для выявления холинэстеразной активности можно вместо ацетилтиохолиниодида использовать бутирилтиохолинио-дид.

ВЫЯВЛЕНИЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ПО КЁЛЛЕ(КОЕ1ХЕ) В МОДИФИКАЦИИ ЛЬЮИСА (LEWIS, 1961)

МЕТОДИКА

1. Перфузия для промывания кровеносных сосудов изотоническим раствором сульфата натрия, подогретым до температуры тела, а затем для фиксации 10%-ным формалином в изотоническом растворе сульфата натрия (16,2 г безводного Na2S04 на 1 л воды), 15—30 мин. После этого ткань режут на кусочки не толще 1 см и погружают в тот же фиксирующий раствор на 6—18 ч при температуре + 4°С. Промыть в 2—3 сменах дистиллированной воды и поместить в 20%-ный этанол, в котором ткань можно хранить при + 4°С несколько недель без потери активности фермента. Согласно Льюису, такая обработка оптимальна.

2. Приготовление замороженных или криостатных срезов толщиной 10—20 мкм.

3. Инкубация в «висячей» капле (предметное стекло накладывается в перевернутом виде на инкубационную среду)—при -(-37°С в течение 1 ч, а при +4°С—в течение ночи—в следующей среде: 10 мг ацетилтиохолиниодида (11 мг бутирилтиохолиниодида) растворяют в 0,4 мл дистиллированной воды, осаждают 0,7 мл 0,1 М CuS04 (25 г/л CuSCy5H20) при добавлении по каплям и встряхивании, после чего оставляют раствор на 10 мин; осадок удаляют центрифугированием при 2000 об/мин. В 1 мл

236 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

над осадочной жидкости растворяют 6,2 мг глицина; рН этого раствора в зависимости от выявляемого фермента доводят 1 М ацетатом натрия до 4,5—6,0. Объем среды доводят дистиллированной водой до 5 мл.

4. После инкубации срезы тщательно промыть в дистиллированной воде.

5. Помещение в раствор сульфида (2—3 г сульфида натрия чд.а.—быстро взвесить—растворить в 90—135 мл 0,2 н. уксусной кислоты; рН довести 1 н. уксусной кислотой или 1 н. ацетатом натрия до 5—6. Раствор следует готовить в день опыта), 1—2 мин.

6. Тщательно промыть в проточной и дистиллированной воде.

7. Обезвоживание в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол, заключение в энтеллан. Возможно также заключение в глицерин — желатину (после п. 6).

РЕЗУЛЬТАТ

Ацетилхолинэстеразная активность маркируется осадком черного цвета.

ПРИМЕЧАНИЯ

Реакция особенно пригодна для исследовательских целей. В отличие от реакции Гомори она позволяет выявлять тончайшие волокна, содержащие АХЭ. Заключение в глицерин — желатину неблагоприятно влияет на результаты реакции.

МЕТОД С ТИОХОЛИНОМ И ФЕРРОЦИАНИДОМ МЕДИ ДЛЯ ЭЛЕКТРОН-HO-МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ПО КАРНОВСКОМУ И РУТСУ (KARNOVSKY, ROOTS)

МЕТОДИКА

1. Фиксация: а) фиксация перфузией 3%-ным глутараль-дегидом на фосфатном буфере (рН 7,6), 15—30 мин, с последующей фиксацией погружением на 2—4 ч при температуре 2 -4 С; б) маленькие кусочки ткани фиксировать

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 237

в 4%-ном формалине на 0,75 М фосфатном буфере (рН 7,6) с добавлением 0,44 М сахарозы, 2—4 ч при температуре 2-^°С.

2. Фиксированную ткань просушить фильтровальной бумагой и промыть в 0,44 М сахарозе, 16 ч при температуре 2-4°С.

3. Срезы толщиной 50—80 мкм приготовить на резаке или замороженные срезы толщиной 50 мкм приготовить на замораживающем микротоме и поместить их в 0,44 М сахарозу при температуре 2—4°С.

4. Предварительная инкубация срезов с ингибитором в 0,1 М Na-малеатном буфере (рН 6,0) 1 ч при температуре 2—4°С. Ингибиторы: 10~ 4 М изо-ОМФА (ингибитор холинэстеразы).

5. Инкубация в течение 15—120 мин при 0°С (ледяная баня) в следующей среде:

Ацетилтиохолиниодид 5,0 мг

0,1 М натрий-малеатный

страница 36
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.06.2019)