Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

около 1—2 мин.

5. Срезы тщательно промыть в дистиллированной воде в нескольких сменах.

6. Заключить в глицерин — желатину или обезводить в ряду спиртов возрастающей концентрации, просветлить в ксилоле и заключить в нейтральный бальзам.

224 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

РЕЗУЛЬТАТ

Активность фермента проявляется коричневато-черным окрашиванием в местах выпадания осадка сульфида свинца.

КОНТРОЛЬ

Реакция после инкубации без субстрата или после добавления 0,01 М фторида натрия в инкубационную среду должна быть отрицательной.

ПРИМЕЧАНИЯ

Наиболее надежные результаты получают на свободно плавающих срезах. При фиксации ацетоном с последующей заливкой в парафин под вакуумом время инкубации в зависимости от исследуемой ткани следует увеличивать до 4 ч. Обезвоживание срезов и заключение через ксилол в нейтральный бальзам или другие синтетические заливочные среды ведет к небольшим потерям осадка сульфида свинца, который указывает локализацию ферментативной активности.

Кусочки ткани, фиксированной в холодном формалине, хранятся в 0,88 М сахарозе или 1%-ной гуммиакации (+4° С) несколько недель без существенных потерь ферментативной активности. Выраженных посмертных изменений в локализации кислой фосфатазы в первые 6 ч не наблюдается.

ВЫЯВЛЕНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ С НАФТО-ЛОМ-AS- И ГЕКСАЗОТИРОВАННЫМ ПАРАРОЗАНИЛИНОМ ПО ЛОЙДЕ (LOJDA, 1962)

МЕТОДИКА

1. Фиксация маленьких кусочков ткани в кальций — формоле по Бейкеру при +4° С, 12—24 ч; приготовление замороженных или криостатных срезов. Постфиксация свежих замороженных срезов в холодном кальций — формоле, 15 — 60 мин, промыть в холодной воде, 5 мшг

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 225

2. Инкубация 30—90 мин при комнатной температуре (при + 37 С время инкубации сокращается) или в холодильнике (несколько часов) в следующем растворе:

Нафтол-AS-BI-фосфат 5 мг (свежерастворенный в 0,25 мл

диметилформамида) 0,1 М ацетатный буфер 10 мл (добавлять сразу) (рН 5,0—5,5)

5% MgCl2 1 — 2 капли

Гексазотированный 0,3—0,9 мл

парарозанилин

Проверить и, если необходимо, установить нужную величину рН; раствор ^профильтровать!

Приготовление гексазотиррванного парарозанилина. Равные части холодного 4%-ного парарозанилина в 2 н. HQ и холодного 4%-ного водного NaNOj слить при постоянном помешивании на; ледяной бане, пока раствор не приобретет бледно-желтый цвет (около 1—2 мин). 1, и, Na-ОН добавлять по каплям до рН 6,0 (из-за быстрого испарения жидкости проверку рН следует проводить быстро!).

3. Срезы промыть в дистиллированной и проточной воде.

4. Заключить в глицерин — желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

Активность неспецифической кислой фосфатазы проявляется выпадением осадка светло-красного красителя.

КОНТРОЛЬ

Как при методе Гомори.

ПРИМЕЧАНИЯ

Рекомендуется перед приготовлением замороженных или криостатных срезов промывать кусочки ткани, фиксированные в кальций — формоле, 3—4 ч, или дольше в холодном 7,5%-цом растворе сахарозы. Светло-желтое окрашивание раствора гексазотированного парарозанилина не мешает реакции. Загрязнение красителя, а также неполное

8-235

226 4~. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

гексазотирование приводит иногда к сильному неспецифическому окрашиванию фона.

ЭЛЕКТГОННО-МИкРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ СОЛЕЙ СВИНЦА (MAUNSBACH, 1966, ПО GOMOR1, 19S2)

МЕТОДИКА

1. Маленькие кусочки ткани фиксировать в 2—3%-ном глутаральдегиде на ОД М какодилатном буфере, рН 12 при температуре от О до +4°С, 2-4i

2. Промыть в 0,1 М какодилатном буфере (рН 12) с добавлением 7,5%-ной сахарозы при температуре от 0 до +4°G, 2—4 ч. " ' '

3. Замороженные срезы толщиной 30-^50 мкм, полученные на резаке, собрать в буфершдй раствор.

4. Инкубация 7—^15 мин при +ЗТС в следующей среде: - ¦' '*•

Na-B-глвцерофосфат 10 мл

0,05 М ацетатный буфер (рН 5,0—A3J- 10 мд: 0,2%-ный нитрат свинца 20 мл

Дистиллированная вода 10 мл

5. Срезы промыть в 0,05 М ацетатном буфере (рН 5,0—5,3), 2—5 мин. {Для контроля можно несколько срезов проявить в растворе сульфида аммония.)

6. Дофиксация в забуференном растворе OsO*: 12,5 мл 2% 0s04, 5,5 мл 0,1 н. НО, 1,8 мл 8,5% NaCl, 5 мл 0,1 М веронал-ацетатного буфера (рН 12), 30 мин— 1 ч, или обезвоживание срезов без дофиксации.

7. Обезвоживание в этаноле, заливка в эпон или микро-пап (вестопап). Контрастирование на ультратонких срезах.

РЕЗУЛЬТАТ ,, ¦ ' . ,

Вьшадение в осадок продуггареакшш про стах локализации активности кислой фосфатазы в лизосомах и в комплексе Гольджи.

4. П

отдельных классов веществ и ферментов 227

КОНТРОЛИ

Инжубация среды без субстрата. Добавление в инкубационную смесь 0,01 М NaF.

ПРИМЕЧАНИЯ

Результаты реакции зависят от качества субстрата. При наличии в субстрате небольшого количества ot-изомеров образовании осадка практически не тюисходит. При использовании Na-B-глицерофосфата с содержанием всего 0,1% а-изомера Маунсбаху (Maunsbach, 1966) не удалось наблюдать осадка ни в ядре, пи в цитоплазме. Неспецифическое окрашивание фона удается в значительной мере npeAuiupaiHib, если срезы после инкубации (п. 4) промыть в 2%-пой уксусной кислоте не более 30 с (как Правило, однако, достаточно нескольких секунд). При этом, по-видимому, частично вымывается и специфический осадок (Desmet).

ВЫЯВЛЕНИЕ КАЛЬЦИЙ АКТИВИРУЬМОЙ АТФАЗЫ С ПОМОЩЬЮ КАЛЬЦИЙ—КОБАЛЬТОВОГО МЕТОДА ПО ПАДИКУЛЕ И ГЕРМАНУ (PADYKU1A, HERMAN. 1955) В МОДИФИКАЦИИ НОВИКОВА И ДР. (NOVI-KOFF ET AL, 1961)

МЕТОДИКА

1. Ткань быстро заморозить на сухом льду или в охлажденном изопентане.

2. Приготовить замороженные или криостатные^ срезы тшшщном 15 мкм и перенести их кисточкой в холодный (от —2 до —3°С!) 10%-ный раствор нейтрального кальций — формола (10 мл 35—40%-ного формальдегида, 90 мл 1%-ного раствора Са02, добавить несколько кусочков карбоната кальция, нгюфнлыровать), 10 мин."

3. Срезы промыть в 1%-ном растворе хлорида кальция, 2 мин.

4. Инкубация свободномшавающих срезов, 15 мин при

«*

228 4. Гистохимия отдельны* классов веществ и ферментов_

37°С, в следующей свежеприготовленной среде:

0,t М (2,062%) барбитурат натрия 20 мл

2% СаС12 , 10 мл

Дистиллированная вода 30 мл

АТФ (натриевая соль) 152 мг

Установить рН 9,2 — 9,4 добавлением 0,1. н, NaOH и довести раствор, дистиллированной водой до 100 мл.

5. Промыть срезы в 3 смендх 1%-ис?р раствора СаС12. . 6. Перенести срезы в 2%-ный распор хлорида (или нитрата.) кобальта, 3—5 мин.

7. Промыть в 4 сменах дистиллирдаанной воды, всего 1 мин. ,. ,

8. Обработка раствором сульфида аммония (несколько капель на 100 мл дистиллированной; воды), 3—5 мин.

9. Промыть в нескольких сменах дистиллированной и проточной воды, Зт,5 мин., й .. „,

10. Заключение под покровное стекло в глицерин— желатину или обезвоживание в ряду спиртов возрастающей концентрации; просветление в ксилоле, нейтральный бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Локализация ферментативной активности маркируется черным осадком сульфида кобальта.

КОНТРОЛЯ

а) Инкубация в среде без субстрата.

б) Инкубационная; среда без СаС12 для выявления спонтанного гидролиза. I

в) Инкубация в растворе с заменой аденозинтрифосфа-та Na-'Э-глицерофосфатом или п-нитрофенилфосфатом, инозиндифосфатом или другими дифосфатами в равных количествах.

г) Добавление 2,5-10 ~ 3 М n-хлормеркурибензоата в инкубационную среду.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 229

ПРИМЕЧАНИЯ

Высвобождение фосфатов может быть усилено добавлением в инкубационную среду 2,4-динитрофенола (Niles et al.). Если исследуемая ткань содержит мало кальция, рекомендуется увеличить до 5 мин обработку срезов в 1%-ном растворе СаС12 (п. 3).

Для успеха реакции большое значение имеет чистота препарата АТФ. Опыт показывает, что субстрат может храниться в холодильнике, оставаясь пригодным для гистохимических целей не более 1 года.

СВИНЦОВЫЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ АТФАЗЫ ПО ВАКСТАЙНУ И МАЙ-ЗЕЛ (WACHSTEIN, MEISEL, 1956) В МОДИФИКАЦИИ ФАРКУХАР И ПАЛА-ДА (FARQUHAR, PALADE, 1966)

МЕТОДИКА

1. Фиксация маленьких кусочков ткани в следующих растворах: а) 1,5%-ный глутаральдегид (свежая дистилляция!) в 0,067 М какодилатном буфере (рН 7,2) при + 4°С, 2—4 ч или

б) кальций — формол по Бейкеру при + 4°С, 16—24 ч.

2. Промывка и при необходимости хранение срезов при -I- 4°С в 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2) с добавлением 7,5%-ной сахарозы после фиксации в глутаральдегиде или в 7,5%-ной сахарозе без буфера после фиксации по Бейкеру. (Хранение в течение нескольких недель не ведет к снижению АТФазной активности.)

«. 3. Срезы ткани толщиной 10 мкм (при световой микроскопии) или 50 мкм (при электронной микроскопии), приготовленные на замораживающем микротоме или резаке.

4. Инкубация 10—90 мин при комнатной температуре или при + 37° С в следующей среде:

26 мг АТФ (натриевая соль) в 0,83 мМ

50 мл шрмс-малеатного буфера (рН 7,2); 80 мМ

растворить 123 мг MgS04 н 10 мМ

40 мг Pb(N03)2 2,4 мМ

Установить рН 7,2 с помощью NaOH!

5. Дальнейшая обработка срезов:

а) Для световой микроскопии: промывка в дистиллиро-

230 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ванной воде, помещение в 1%-ный сульфид аммония, 1 мин; промывка в нескольких сменах дистиллированной воды и заключение под покровное стекло в глицерин — — желатину.

б) Для электронной микроскопии: промывка срезов толщиной 50 мкм в веронал-ацетатном буфере (рН 7,4) с добавлением 7,5%-ной сахарозы, 5 мин. Фиксация срезов в 1% 0s04 на фосфатном буфере (рН 7,6), 45 мин. Обезвоживание в ряду спиртов возрастающей концентрации, заливка в аралдит или микропал (вестопад). Контрастирование срезов: обработка срезов перед обезвоживанием в 0,5%-ном уранилацетате на веронал-ацетатном буфере, 1—2 ч, или контрастирование ультратонких срезов 0,5%-ным уранилацетатом.

РЕЗУЛЬТАТ

При световой микроскопии осадок, сульфида свинца маркирует места ферментативной активное™.

При электронной микроскопии локализацию АТФаз-ной активности маркирует осадок фосфата свинца.

страница 35
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.06.2019)