е моно- и полиэфиры. Поскольку ацильная группа может быть алифатической или ароматической, а вторая группа агиртовой или фенольной, обычно используемый термин «липаза» мало чем отличается от определения «эстераза». Для гистохимического выявления липаз обычно используют в качестве субстратов различные виды твинов, которые могут, однако, расщепляться и неспецифическими эстеразами. Разработанный Гомори метод с солями металлов для выявления липаз не позволяет получать достаточно определенных результатов и поэтому не может считаться надежным для выявления этих ферментов.

4.5.3.2.3. АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗА (КФ 3.1.1.7)

Встречающаяся в эритроцитах, в нервной ткани и в двигательных концевых пластинках ацетилхолинэстераза (аце-тилхолингидролаза, «истинная», или «специфическая» хо-линэстераза, АХЭ) расщепляет преимущественно ацетилхолин—известный нейромедиатор. Этот фермент гидро-лизует, однако, и эфиры, не столь близко родственные ацетилхолину по своей структуре. Кроме того, особен-

7-235

Методы выявления неспецифических : Таблица 40 стераз с помощью световой и электронной микроскопии (Lojda, 1972) Метод Авторы Примечания0

а-Нафтилацетат + Гексазоний-л-роза-нилин Тиолуксусная кислота + РЬ2+ 8-пропионокси-5-нитрохинолин + Bi3 + Индоксилацетат + Гексазоний й-роза-нилин Индоксилацетат + Тетразоний-N, N'-бис (л-аминофенил)-1,3-ксилендиа-мин Нафтилтиолацетат или 2-тиолацеток-сибензанилид + Прочный синий BBH+TCH + Os04 Тиолацетоксибензанилид + Си2++ + Железо (III)—цианид калия л—Нитрофенилтиолацетат.-пропио-нат, -бутират+ Аи Lehrer, Ornstein (1959) Wachstein et al. (1961) Deimling (1965) Holt, Hicks (1966) Kawashima (1968) Seligmaa et al. (1966) Hanker et al. (1972) Vatter et al. (1968) С: хорошо пригоден Э: плохой контраст С и Э: хорошо выявляются лизосомы; возможен спонтанный распад субстрата С: предпочтительное выявление эстеразы А С: хорошее выявление, особенно лизосомных эстераз Э: контраст от умеренного до слабого Э: многообещающий метод Э: возможны артефакты при образовании азокрасителей; кроме того, неполный переход липидов в нерастворимую форму С и Э: точное выявление лизосом Э: возможно выявление лизосом, субстрат нестабильный

Продолжение табл. 40

Метод Авторы Примечания1'

Нафтол-AS-D-ацетат + Последующее сочетание с диазониевыми солями фталоцианинов свинца (5-нитро)-8-оксихинолинацетат, -про-пинат, -бутират + ВР+ 8-Меркаптохинолинбутират +ВР+ или Fe2++8-меркаптохинолинацетат Livingston et al. (1969) Deimling, Madreiter (1972a) Deimling, Madreiter (1972b) Э: выявление лизосомных и рибо-сомных эстераз сомнительно из-за артефактов диффузии Э: локализация продуктов реакции преимущественно в митохондриях и липидных каплях, кроме того, в лизосомах и цистернах эндоплаз-матического ретикулума С: результаты реакции, как с а-нафтилбутиратом и прочным синим В Э: продукты реакции локализуются главным образом в цистернах гранулярного эндоплазматического ретикулума

1) С - световая микроскопия, Э - электронная микроскопия.

196 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ность данного фермента состоит в том, что в отличие от холинэстеразы он подавляется высокими концентрациями субстрата.

Для светомикроскопического выявления холинэстеразы были разработаны следующие методы: 1) с тиохоли-ном меди и солями металлов, 2) с тиолуксусной кислотой, 3) с осмиофильным тиоловым эфиром, 4) прямого окрашивания с тиохолином по Карновскому и Рутсу (Karnovsky, Roots).

Прямое выявление АХЭ по ферментному белку возможно с помощью иммуногистохимического метода (Ben-da, 1970), а также с помощью маркированных ингибиторов (Ostrowski, Bernhard, 1963). Специфическое выявление ацетилхолинэстеразы и холинэстеразы возможно лишь при использовании специфических ингибиторов. Отдифференцировать оба этих фермента от неспецифических эстераз можно по их чувствительности к эзерину (физостигмину). Избирательное подавление активности АХЭ достижимо с помощью BW284c51, тогда как активность холинэстеразы подавляется мипафоксом или изо-ОМРА.

Перечисленные методы имеют как преимущества, так и недостатки. Метод Кёлле и Фриденвальда (Koelle, Frie-denwald), открывших в 1949 г. эру гистохимического выявления АХЭ, основан на следующем принципе:

Ацетилхолин + Си2 + -» Тиохолин + Си2 + -> Тиохолин меди -> Сульфид меди.

В последних публикациях (Tsuji, 1974) высказывается мнение о том, что иод ацетилх олиниодида ответствен за осаждение комплекса меди. Большой недостаток метода Кёлле—Фриденвальда сводится к тому, что положительно заряженный атом азота в тиохолиновом субстрате препятствует его проникновению в ткань. Низкая проникающая способность субстрата, а также проблемы, с которыми сопряжены все неспецифические методы с солями металлов, побудили многочисленных исследователей модифицировать метод Кёлле—Фриденвальда. При использовании в качестве осаждающего реагента свинца или золота вместо меди были получены хорошие результаты. Используя соли золота в методе с тиохолином, Кёлле и Громадский (Koelle, Gromadski) добились довольно тон-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 197

кой локализации ацетилхолинэстеразы и холинэстеразы в двигательных концевых пластинках.

Метод «прямого окрашивания» (Karnovsky, Roots. 1964) представляет собой шаг вперед по сравнению с другими тиохолиновыми методами, особенно если речь идет об электронной микроскопии. Принцип этой реакции заключается в восстановлении тиохолином, высвобождающимся под действием фермента феррицианида до ферро-цианида. Ферроцианид образует с ионами меди нерастворимый электроноплотный осадок коричневого цвета (коричневый пигмент Хэтчетта). Для подавления неспецифической реакции с феррицианидом ионы меди связываются в комплекс с цитратом. Образование продукта реакции, устойчивого по отношению к Os04, делает возможным перенос этого метода на ультраструктурный уровень.

Хэнкеру (Hanker) удалось путем связывания осмиевой чернью усилить и стабилизировать продукт реакции в местах образования коричневого осадка ферроцианида меди. Соединение ферроцианида меди с четырехокисью осмия осуществляется посредством тиокарбогидразида или в результате окислительного сочетания с 3,3 -диаминобензиди-ном (ДАБ).

Ацетштин-

tCH,),NCH2CH2SCOCHs эстеРаза „ rCHs),ficHjCH2SH

J" РН5'6 j-

cu*;/

/Nd/«(CN),H20 CU|Fc(CN)6-7Hz0| Ферроцианид меди

(1) H2NNHCSNHNH2 | (1) ДАБ

OB

(2) OsQt, J (2) OsOi,

Осмиевая чернь Методы ультраструктурного выявления АХЭ можно разделить на четыре группы; каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. При попытках найти корреляцию между локализацией фермента и его функцией всегда выявлялись противоположные мнения.

198 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

4.5.3.2.4. ХОЛИНЭСТЕРАЗА (КФ 3.1.1.8)

Холинэстеразы, встречающиеся во многих органах, расщепляют бутирилхолин быстрее, чем ацетилхолин. Поскольку для гистохимического выявления этого фермента часто используют бутирилтиохолиниодид, фермент называют также бутирилхолинэстеразой. Гистохимическое выявление холинэстеразы лучше всего удается с помощью метода Карновского и Рутса в сочетании с соответствующими контрольными опытами и ингибированием.

4.5.3.3. СУЛЬФАТАЗЫ

Эти ферменты катализируют обратимый гидролиз эфиров серной кислоты:

ROS03H + Н20 ?± ROH + H2S04.

Сульфатазы широко распространены в тканях высших животных. Они выполняют в организме самые разнообразные функции (участвуют, например, в обмене углеводов, в обезвреживании ядов и в синтезе стероидов), но их физиологическое значение еще не полностью выяснено. На основании биохимических данных арилсульфатазы были разделены на 3 группы: арилсульфатазы А, В и С. Арилсульфатазы А и В локализуются во фракции лизосом; предполагается, что тип В связан с мембранами лизосом, тогда как тип А локализуется внутри лизосом. Сульфатаза С выявляется в микросомной фракции и как фермент, обладающий активной SH-грушюй, подавляется цианидом. Эти три типа сульфатаз удается различать по их субстратной специфичности в отношении и-нитрокатехол-сульфата и и-нитрофенилсульфата или и-ацетилсульфата, а также по их устойчивости к действию KCN.

Гистохимическое выявление арилсульфатаз требует предварительной фиксации ткани (глутаральдегид или формалин). Имеется 3 основных принципа выявления этих ферментов: реакция азосочетания, реакция осаждения солями металлов и индигогенные методы.

Методам осаждения солями металлов в настоящее время отдается предпочтение, поскольку с их помощью удается определять локализацию фермента и на электронно-ми-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 199

кроскопическом уровне. Чаще всего используют в качестве субстрата и-нитрокатехолсульфат, который расщепляется арилсульфатазами А и В. Для осаждения высвобождающихся ионов сульфата используют ионы РЬ2+ и Ва2+. Для световой микроскопии рекомендуется использование ионов свинца, которые могут быть переведены в видимый глазом сульфид свинца; сульфат бария выявляется лишь с помощью фазово-контрастного микроскопа. При помощи электронной микроскопии в лизосомах удается наблюдать более равномерное распределение осадка при использовании Ва , чем при осаждении РЬ2+. К этому следует добавить, что барий даже при высоких концентрациях не подавляет активности этих ферментов.

4.5.3.4. ГЛИКОЗИДАЗЫ

Гликозидазы растительных и животных тканей расщепляют гликозидные соединения следующего строения:

^ ЖО— R

Речь идет о связи между кислым остатком сахара и щелочным остатком другого соединения (R), которое может быть сахаром или спиртом. Существовавшее ранее представление об узкой специфичности гликозидаз требует лересмотра. Так, например, кислая (3-галактозидаза способна расщеплять и p-D-фукозиды (Lojda, 1972).

В гистохимии используются как методы азосочетания, так и индигогенные методы. С их помощью выявляют целый ряд ферментов этой группы, такие, как 3-глюкози-дазу, р-галактозидазу, Р-глюкуронидазу и Р-ацетилглю-козаминидазу. Три последних фермента локализуются в лизосомах.

4.5.