Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

ать возможность артефактов диффузии в реакциях образования азокрасителей с использованием в качестве сочетающих реагентов диазотированных фталоцианинов свинца, а также хлоридов диазония, содержащих свинец.

4.5.3.1.3. 5'-НУКЛЕОТИДАЗА (КФ 3.1.3.5)

5'-Нуклеотидаза (аденозинмонофосфатаза) является специфической фосфомоноэстеразой. Этот фермент расщепляет аденозин-5 -фосфат, так называемую мышечную адениловую кислоту и инозин-5'-фосфат. рН-Оптимум лежит между 12 и 8,5, а также в кислой зоне между 3,5 и 5,5. В нервных клетках при рН 5,5 этот фермент помимо лизосом, цистерн и пузырьков комплекса Гольджи, выявляется также в ядре и эргастоплазме. При нейтральных и щелочных значениях рН активность этого'фермента выявляется преимущественно на мембранах. В отношении функционального значения локализации этого фермента имеются различные данные, что, возможно, определяется выбором исследуемой ткани. В частности, значение этого фермента обсуждается в связи с использованием предшественников нуклеозидфосфатов.

Гистохимическое выявление 5 -нуклеотидазы основано на разработанном Вакстейном и Майзел (Wachstein, Mei-sel) методе с применением соли свинца, который оказался приемлемым и для электронно-гистохимического выявления этого фермента. Надежные результаты дает также метод Найду и Пратта (Naidoo, Pratt), в котором для осаждения ионов фосфата также используются ионы свинца. Выявление активности 5 -нуклеотидазы в лизосомах при рН 4,5 удается как с помощью световой, так и электронной микроскопии (Galabow, Davidoff, 1973). Для установления специфичности реакции при рН 7,5 и выше необходимо исключить активность щелочной фосфатазы при помощи ингибитора. Никель и цинк подавляют 5 -нуклеотидазу пол-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 183

ностью, тогда как активность неспецифической щелочной фосфатазы всегда остается неизменной. Специфичность реакции в кислой зоне следует проверять с помощью ингибиторов, подавляющих активность кислой фосфатазы.

4.5.3.1.4. АДЕНОЗИНТРИФОСФАТАЗЫ (КФ 3.6.1.3; КФ 3.6.1.4)

Аденозинтрифосфатазы (аденилпирофосфатазы, моно-фосфоаденозинтрифосфатазы) играют центральную роль в обмене веществ в клетке. Эти ферменты катализируют отщепление концевой ортофосфатной группы от аденозин-трифосфата (АТФ). При этом образуется аденозиндифос-фат:

ООО

п п II ^ АТФ аза^

Аденозин -р-о-Р-о-р-о-он + н.о ill г он он он

о о

и и

Аденозин -р-о-р-он + н.рОд it о* он

Химическая энергия, высвобождающаяся при расщеплении пирофосфатной связи, используется в различных процессах в клетке. При участии АТФазы осуществляется не только высвобождение энергии при расщеплении АТФ, но и обратный синтез АТФ из АДФ (аденозиндифосфата) при окислительном фосфорилировании. Из печени крысы было выделено два типа АТФазы—активируемая кальцием миозин-АТФаза (КФ.3.6.1.3) и активируемая магнием митохондриальная АТФаза (КФ 3.6.1.4). Свойства и локализация этих ферментов охарактеризованы в табл. 38.

Можно с уверенностью предположить существование в клетке многочисленных изоферментов АТФазы с различными рН-оптимумами. Их гистохимическое выявление возможно лишь путем проведения реакции при различных значениях рН.

Большого внимания заслуживает топохимия АТФазы, активируемой ионами натрия и калия (Na-K-АТФаза, или. транспортная АТФаза). С уверенностью можно утверждать, что этот очень лабильный фермент был выявлен с помощью гистохимических методов только в сарколемме.

184 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов_

Таблица 38

Типы АТФазы

Тип АТФазы Локализация в клетке Активатор Ингибитор

Миозиновая АТФаза (активируемая кальцием) Митохондриалыгая АТФаза (активируемая магнием) Са2+, Ва2+, Sr24-2,4-динитрофенол (ДНФ) Mg2*, Мп2+, Со2+ 2,4-динитрофенол в присутствии Mgr* Mg2+ п-Хлормеркурибензо- ат (пХМБ) Са2+, NaF п-Хлоромеркурибен- зоат (пХМБ) Формальдегид 80 - 90%-ный

По-видимому, новые перспективы открывает гистохимическое выявление активности Na-K-АТФазы, подавляемой NaF. При этом в качестве активатора используют ионы калия, в качестве субстрата—п-нитрофенилфосфат, а вместо свинца в качестве осаждающего агента—стронций. В отличие от свинца стронций не подавляет активность фермента.

Гистохимическое выявление АТФазы основано на принципе Гомори и Такаматсу (Gomori, Takamatsu), разработанном для визуализации активности щелочной фосфатазы с помощью солей металлов. Высвобождающаяся под действием фермента фосфорная кислота сначала осаждается находящимися в инкубационной среде ионами металла. На следующем этапе образовавшаяся соль металла переводится в видимый глазом (бурый или черный) осадок сульфида металла:

(NH4)2SONa2S

Ат Д) язя ^

Mg + АТФ г* Mg • АТФ--Mg • АДФ + PbS

В качестве субстрата, как правило, используют АТФ. Вместо него можно использовать другие нуклеозидтри-фосфаты, например инозинтрифосфат (ИТФ) или уридин-трифосфат (УТФ), или же нуклеозидцифосфаты.

Удовлетворительное топохимическое выявление фермента зависит в первую очередь от следующих двух факто-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 185

ров: от предварительной обработки ткани и от концентрации ионов свинца, используемого для осаждения фосфатов. В этом случае фиксацию замороженных или криостатных срезов рекомендуют проводить после проведения гистохимической реакции; в качестве фиксирующей смеси рекомендуется раствор формалина с кальцием, охлажденный на ледяной бане. Равным образом пригодна фиксация в 2%-ном холодном забуференном растворе глута-ральдегида. Для выявления Са — АТФазы необходимо использовать нефиксированные замороженные или криостатные срезы.

Хотя фиксация в формалине и глутаральдегиде ведет к значительной инактивации фермента, сохраняющаяся активность АТФазы оказывается достаточно высокой для ее гистохимического выявления.

В результате использования ионов свинца в инкубационной среде часть ферментативной активности подавляется и одновременно усиливается неферментативный гидролиз нуклеозидфосфатов. Из этого следует, что выпаде-* ние продукта гистохимической реакции не во всех случаях обусловлено ферментативными факторами. Использование тирона в качестве комплексообразующего агента позволяет уменьшить ингибирующий эффект и значительно ограничить диффузию продукта реакции. Выше упоминалось о больших возможностях, которые нам дает использование стронция в качестве осаждающего агента. Проводимые до сих пор исследования показали, что при концентрации ионов свинца в инкубационной среде 2? мМ, достигается удовлетворительное выявление АТФазы при значительном ограничении диффузии продукта реакции.

В световой и электронной микроскопии для выявления аденозинтрифосфатаз используется принцип Вахстайна и Майзел (Wachstein, Meisel). Однако гистохимическое выявление Na-K-зависимой АТФазы в различных тканях наталкивается на серьезные трудности. Хорошие результаты позволяют получать методы Шульце и Волленбергера (Schulze, Wollenberger, 1971), Палкама и сотр. (Palkama et al., 1972), а также гистохимическая модификация биохимического метода Скоу по Фаркухар и Паладу (Farquhar, Pa-lade, 1966). Надежность выявления этого фермента обусло-

186 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

вливается четким подавлением ферментативной активности специфическим ингибитором уабаином в контрольных срезах.

4.5.3.1.5. ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТАЗА <КФ 3.1.3.9)

Эта специфическая фосфомоноэстераза расщепляет глюкозо-6-фосфат:

Глюкозо-6-фосфат г™103<ЯЦюсфата> Глюкоза + Ортофосфат.

+ н2о

Фермент связан с микросомной фракцией и может служить маркером гранулярного и агранулярного (гладкого) эндоплазматического ретикулума. Кроме того, он локализуется и в ядерных мембранах. В аппарате Гольджи и других органеллах этот фермент не обнаруживается. В разных органах активность глюкозо-6-фосфатазы различна. Наиболее высокая активность данного фермента выявлена в печени. В почках, тонком кишечнике, плаценте, мозге и других органах активность его ниже. Очень низкой, но все же гистохимически выявляемой активностью глюко-зо-6-фосфатазы обладают клетки миокарда. Оптимум активности фермента лежит при рН 6,0; в изолированном состоянии он наиболее активен при рН 8,0; при рН 5,0 он денатурируется.

Функциональное значение глюкозо-6-фосфатазы в первую очередь определяется высвобождением глюкозы в кровоток. Врожденная недостаточность этого фермента в печени, где он обычно содержится в максимальной концентрации, лежит в основе известной генетически обусловленной болезни накопления гликогена.

При предварительной обработке ткани для гистохимического выявления глюкозо-6-фосфатазы следует обращать внимание на значительную чувствительность фермента к действию фиксатора. Фиксация погружением в холодный формалин или глутаральдегид приводит к значительной инактивации фермента. Наилучшей можно считать непродолжительную фиксацию перфузией глутараль-дегидом в низкой концентрации. Поскольку гистохимическое выявление этого фермента проводится при рН 6,5,

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 187

следует учитывать возможность неспецифической реакции за счет щелочной и кислой фосфатаз. Эти трудности удается обойти при помощи блокады SH-групп, что ведет к подавлению активности глюкозо-6-фосфатазы, тогда как активность неспецифических фосфатаз остается без изменений. Для контроля специфичности можно, кроме того, использовать в качестве субстрата Na-P-глицерофосфат вместо глюкозо-6-фосфата, инактивацию ферментативной активности путем обработки кислотой и 1,5-сорбитан-6-фосфат в качестве специфического ингибитора.

Гистохимический метод выявления глюкозо-6-фосфа-тазы был разработан Чикуином (Chiquoine) на основе принципа осаждения солями металлов по Гомори (Gomo-ri). На этом же принципе основаны дальнейшие модификации этого метода по Вакстейну и Майзел для световой микроскопии и по Хугону, Боргерсу и Маэстрацци—для электронной.

4JJ.1.6. ТИАМИНПИРОФОСФАТАЗА

Данный фермент катализирует отщепление концевых фосфатных групп тиаминпирофосфата. При этом необходимо присутствие ионов двухвалентных металло

страница 28
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)