Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

АНИЕ

Согласно Хольцингеру, использование замороженных срезов свежего материала является важной предпосылкой для получения надежных результатов. Адаме (Adams, 1955) считает этот метод абсолютно специфичным для выявления свободных жирных кислот.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 171

ПЛАЗМАЛЕВАЯ РЕАКЦИЯ ПО ХАЙЕСУ (HAYES, 1949) МЕТОДИКА

1. Фиксация ткани в кальций — формоле, 3—6 ч.

2. Замороженные срезы прикрепить к предметному стеклу.

3. Обработка в 1—5%-ном растворе хлорида ртути, 10 мин.

4. Промыть в трех сменах дистиллированной воды.

5. Поместить срезы в реактив Шиффа, 20 мин.

6. Промыть срезы в 802-воде, 3x1 мин.

7. Промыть-в проточной воде, 20 мин.

8. Заключить под покровное стекло в глицерин—желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

В срезах, обработанных сулемой, плазмали окрашиваются в красно-фиолетовый цвет. Контрольные срезы после п. 2 переносятся непосредственно в реактив Шиффа.

ПРИМЕЧАНИЯ

Срезы, не обработанные раствором сулемы, должны оставаться неокрашенными. Появление красноватого окрашивания—признак псевдоплазмалевой реакции, обусловленной окислением ненасыщенных липидов. Высвобождаемые в результате гидролиза липиды блокируются при помощи соответствующих реакций сочетания. Реактив Шиффа можно заменить фенилгидразином.

4.5. ФЕРМЕНТЫ

За последние три десятилетия в области энзимологии были достигнуты поразительные успехи, однако, если биохимикам известно более 900 различных ферментов, гистохимическому изучению доступны лишь около 90 ферментов, т. е. в 10 раз меньше. И все-таки было бы ошибкой предположить, что информация, получаемая с помощью гистохимических методов, настолько же менее содержа-

172 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

тельна. Так, например, при изучении обмена веществ в каком-либо типе клеток нет необходимости выявлять все ферменты данного цикла. Для ответа на поставленный вопрос гистохимику достаточно выявить ключевой фермент (например, начальный или конечный фермент пути обмена веществ). Точный ответ, однако, во многих случаях может быть дан лишь при использовании комбинации различных методов.

4.5.1. РАЗДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

Многочисленные известные нам ферменты можно разделить на шесть основных классов, если за классифицирующий признак принять тип реакции, катализируемой данным ферментом:

1. Оксидоредуктазы. 2. Трансферазы. 3. Гидролазы. 4. Лиазы. 5. Изомеразы. 6. Лигазы (синтазы).

Официальная классификация ферментов основана на рекомендациях Международного биохимического союза. Помимо систематических используются тривиальные наименования ферментов. Например: лактатдегидрогена-за—тривиальное наименование, лактаТ: НАД — оксидо-редуктаза(КФ 1.1.1.27)—систематическое. В гистохимической литературе в последнее время наряду с тривиальными все чаще используются систематические наименования.

В основном гистохимические реакции разработаны для выявления различных оксидоредуктаз и гидролаз. Гистохимическое выявление изомераз и лигаз пока не удается.

4.5.2. ОБЩИЕ QCHOBbI ГИСТОХИМИИ ФЕРМЕНТОВ

Поскольку ферментные белки по реакциям связывания красителей практически не отличаются друг от друга, в основе гистохимии ферментов лежит выявление продукта ферментативной реакции. Специфическое выявление ферментного белка может быть проведено лишь с помощью сложных иммуногистохимических методов (см. стр. 297) При этом следует обращать внимание на то, что гистохимические методы не могут дать сведений о том, в каком состоянии находится фермент—в активном или неактивном.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 173

45.2.1. УСЛОВИЯ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ

Основной задачей гистохимии ферментов является не описание цепей внутриклеточных реакций, а в первую очередь точная локализация ферментативной активности, а следовательно, ферментного белка в клетках и тканях. Под активностью фермента в гистохимии понимают ферментативное превращение какого-либо субстрата. Решающую роль играет точная локализация образовавшегося продукта реакции. В биохимии понятие активности обязательно связано с определенными экспериментальными условиями. Эти условия должны быть подобраны так, чтобы ферментативная реакция протекала при насыщении субстратом, т. е. чтобы скорость превращения не зависела от концентрации субстрата.

Результаты выявления фермента могут дать сведения о его локализации лишь при следующих двух условиях:

1. В процессе подготовки ткани и химического превращения субстрата не должно происходить смещения.

2. Продукт реакции должен выпадать в осадок в том месте, в котором выявляемый фермент находится при жизни клетки.

Выполнение этих условий предполагает использование методов, при которых конечный продукт ферментативной реакции либо сам по себе нерастворим и окрашен, либо может быть переведен в нерастворимый и окрашенный продукт.

При ультрагистохимическом выявлении ферментов место их нахождения должно быть достаточно контрастным. Это возможно при условии, что первичный продукт реакции либо сам имеет достаточную электронную плотность, либо может быть переведен в другое соединение достаточной электронной плотности.

4.5.2.2. ПРИНЦИПЫ ВЫЯВЛЕНИЯ

Наиболее часто используемым принципом .гистохимического выявления гидролитических и окислительных ферментов (гидролаз и оксидоредуктаз) является реакция одновременного захвата, которая также называется реак-

174 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

цией одновременного сочетания. Схематически ее можно представить следующим образом:

Ферментативная Реакция реакция захвата Субстрат-» Первичный ¦--¦+ Конечный

продукт продукт реакции реакции

В так называемой реакции последующего сочетания конечный продукт реакции формируется в два раздельных этапа. Прежде всего срез ткани инкубируют с субстратом. На втором этапе гидролизованный, находящийся преимущественно в нерастворимой форме продукт переводится в нерастворимое окрашенное соединение. При выявлении гидролитических ферментов предпочтение отдается реакциям одновременного сочетания. Исключение составляет метод выявления гетеро-р-галактозидазы.

Результаты ферментативной реакции в значительной мере определяются свойствами первичного продукта. Основным препятствием служит диффузия продукта, которая зависит от скорости гидролиза субстратна, коэффициента диффузии первичного продукта и рН инкубационной среды. Диффузию можно ослабить двумя способами: 1) подбором первичного продукта реакции с большей суб-стантивностью (склонность к связыванию с белками) и 2) большей скоростью сочетания в реакции захвата. Идеальные условия исследования с помощью светового и электронного микроскопа создаются при наличии таких продуктов реакции, которые представляют собой окрашенные полимеры, связывающиеся с белками ткани.

4.5.2.3. ЛИО- И ДЕСМОФЕРМЕНТЫ

Ферменты существуют в клетке, как правило, в двух формах: в виде экстрагируемых, растворимых лиофермен-тов и в виде нерастворимых, связанных с клеточными структурами десмоферментов. Если гистохимическое выявление десмоферментов при наличии подходящих методов не представляет большой сложности, то выявление лиоферментов сопряжено со значительной, а иногда и пол-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 175

ной потерей активности, особенно в процессе инкубации свежей, нефиксированной ткани. Об этом следует помнить, поскольку значительная часть ферментов любого органа находится в лиоформе. С помощью фиксации удается достичь определенной иммобилизации растворимых ферментов. Но и сама по себе фиксация сопряжена с определенными потерями ферментативной активности. Неплохие возможности для светомикроскопического топохимиче-ского выявления растворимых ферментов дает метод полупроницаемых мембран и субстратной пленки. Хотя оба этих метода начали разрабатываться лишь недавно, с их помощью уже была установлена локализация целого ряда ферментов без потери лиоформ.

4.5.2.4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты, которые выявляются с образованием наблюдаемого в микроскоп продукта реакции, могут быть идентифицированы, а их свойства должны быть сравнимы со свойствами ферментов, описанных в биохимических системах. В табл. 36 суммированы имеющиеся возможности установления специфичности и биохимической идентичности локализуемых ферментов.

Гистохимические реакции выявления ферментов следует дополнять контрольными реакциями с активаторами и ингибиторами, проверкой влияния температуры, рН и концентрации субстрата. Ферменты с перекрывающейся субстратной специфичностью удается иногда отдифференцировать по их различной локализации в морфологически выявляемых структурах. Выявление гидролиза различных, но родственных субстратов в разных клетках свидетельствует о том, что некогда в исследуемых типах клеток су-, шествовали различные ферменты. Для дифференцировки перекрывающихся видов ферментативной активности могут быть использованы ингибиторы. Таким путем удается, в частности, разграничить различные типы эстераз в лизосомах.

Биологически важным методом определения ферментативной активности и ее специфичности в гистохимической системе является изучение свойств фермента, проводимое на изолированной ткани. Здесь имеется две

176 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

Таблица 36

Возможности оценки специфичности гистохимических реакций дли выявления ферментов (Glenner)

Полное или частичное исключение локализации

Неконкурентные ингибиторы

Конкурентные ингибиторы

Исключение с помощью ингибитора

Активаторы

Определение рН-оптимума Выделение фермента из ткани

Разделение комплекса ферментов

1. Выявление с помощью различных близкородственных субстратов

2. Сравнительное проведение реакции с полифункциональным субстратом и со специфическим продуктом частичного гидролиза

Подавление связывания фермента с субстратом

Блокирование активных центров фермента

На химически родственные ферменты действует активный ингибитор, специфичный лишь для одного из ферментов

Сравнение с биохимическими данными Сравнение с биохимическими данными Гомогенизация и микропрепарирование с по

страница 26
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.08.2019)