Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

ь в 60%-ном изопропаноле.

164 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

3. Срезы поместить в свежеотфильтрованный, разведенный раствор масляного красного, 10—20 мин. (Раствор масляного красного: 0,5 г масляного красного О растворить в 100 мл 98%-ного изопропанола. Перед употреблением развести дистиллированной водой (6:4), выдержать 24 ч и затем профильтровать.)

4. Быстро дифференцировать в 60%-ном изопропаноле или тотчас промыть в дистиллированной воде.

5. Окрашивание ядер в гемалауне по Майеру.

6. Промыть в проточной воде, 10 мин.

7. Срезы заключить в глицерин—желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

Нейтральные жиры окрашиваются в красный цвет, ядра—в синий.

ПРИМЕЧАНИЕ

Вместо масляного красного О можно рекомендовать в первую очередь масляный красный 7 В, который окрашивает липиды в ярко-красный цвет. Масляный красный 7 В можно также использовать в виде насыщенного отфильтрованного раствора в 70%-ном этаноле.

ОКРАШИВАНИЕ 3,4-БЕНЗПИРЕНОМ ПО БЕРГУ МЕТОДИКА

1. Фиксация в формалине или в кальций—формоле, замороженные срезы толщиной 10 мкм.

2. Обработать срезы раствором бензпирен — кофеина, 20 мин. (Раствор бензпирена: к 100 мл насыщенного отфильтрованного 1,5%-ного раствора кофеина в воде добавить 0,002 г 3,4-бензпирена; раствор выдержать два дня при + 37° С, отфильтровать и развести равным объемом дистиллированной воды. Оставить раствор на 2 ч и вновь, отфильтровать. Колбу с раствором плотно закрыть и по-' местить в темное место; в таком виде его можно хранить' несколько месяцев.)

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 165

3. Срезы быстро промыть в дистиллированной воде.

4. Заключить под покровное стекло с водой и тотчас исследовать под флуоресцентным микроскопом.

РЕЗУЛЬТАТ

Липиды выделяются своей синей или бело-синей флуоресценцией.

ПРИМЕЧАНИЯ

Бензпирен растворяется в липидах ткани. Этот метод не позволяет отдифференцировать различные классы липидов. Цвет флуоресценции—от сине-зеленой до бело-синей и бело-желтой,—по-видимому, зависит от концентрации липидов.

ФЛУОРОХРОМИРОВАНИЕ ЛИПИДОВ ФОСФИНОМ 3r по ФОЛЬКУ И ПОППЕРУ (VOLK, POPPER)

МЕТОДИКА

1. Фиксация в кальций—формоле, приготовление замороженных срезов толщиной в 10 мкм.

2. Замороженные срезы поместить в дистиллированную воду.

3. Срезы обработать 0,1%-ным водным раствором фосфина 3 R.

4* Быстро промыть в дистиллированной воде.

5. Заключить в 90%-ньгй глицерин или дистиллированную воду, исследовать под флуоресцентным микроскопом.

РЕЗУЛЬТАТ

Липиды, включая эфиры холестерина, дают серебристо-белую флуоресценцию. Исключения: жирные кислоты, мыла и холестерин. Благодаря однозначно-диагностируемой флуоресценции необходимость в контрольных реакциях отпадает.

166 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

МЕТОД С ФТАЛОЦИАНИНОМ МЕДИ ПО КЛЮВЕРУ И БАРРЕЙРЕ (KLTJVER, BARRERA)

МЕТОДИКА

1. Фиксация в кальций-формоле по Бейкеру, приготовление замороженных или парафиновых срезов.

2. Срезы поместить в абсолютный этанол.

3. Окрашивание при 56 — 60° С в 0,1%-ном растворе люксолового прочного синего (MBS, ARN, G) в 95%-ном этаноле, 16—18 ч.

4. Срезы промыть в 70%-ном этаноле и в дистиллированной воде

5. Дифференцировать в 0,05%-ном водном растворе карбоната лития, от 30 мин до 2 ч (замороженные срезы, фиксированные в формалине, 90 мин).

6. Промыть в дистиллированной воде.

7. Докраска 1%-ным водным раствором нейтрального красного, от 1 до 30 мин (под контролем микроскопии).

8. Промыть в дистиллированной воде, провести через ряд спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Фосфолипиды, за исключением сфингомиелина, окрашиваются в синий цвет. Окрашиваются также ганглио-зиды, а возможно, и цереброзиды. Сфингомиелин удается окрасить лишь при использовании в качестве растворителя хлороформа вместо этанола. При этом, однако, усиливается неспецифическое окрашивание. Этот метод рекомендуется лишь для парафиновых срезов.

МЕТОД ОКРАШИВАНИЯ ЖЕЛЕЗНЫМ ГЕМАТОКСИЛИНОМ ПО ЭЛЛЕ-ДЕРУ И ЛОЙДЕ (ELLEDER, LOJDA, 1973) ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ

МЕТОДИКА

1. Приготовление свежих замороженных срезов.

2. Срез А в сухом состоянии обработать при температу-

Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 167

ре от 0 до +4° С абсолютным ацетоном (10 мин) и высушить на воздухе.

Срез Б при комнатной температуре экстрагировать смесью хлороформ - метанол (10 мин), а затем быстро промыть в ацетоне и дистиллированной воде.

3. Срезы А и Б фиксировать в кальций—формоле (5—10 мин), а затем промыть в дистиллированной воде.

4. Окрашивание обоих срезов смесью раствора I (3 ча-сти) и раствора II (1 часть), 6—8 мин.

Раствор 1: 298 мл дистиллированной воды, 2 мл концентрированной НС1; FeCl3-6H20-2,5 г; FeS04-7H20-4,5 г.

Раствор II: 100 мл дистиллированной воды; 1 г гематоксилина (растворить при слабом нагревании).

5. Промыть в дистиллированной воде.

6. Несколько раз промыть в 0,2%-ной НС1.

7. Хорошо промыть в проточной воде.

8. Заключить под покровное стекло в глицерин-желатину или после обезвоживания в ацетоне и просветления в ксилоле—в нейтральный бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Фосфолипиды окрашиваются в темно-синий цвет. Их можно идентифицировать, лишь сравнив с окрашиванием срезов, экстрагированных ацетоном и хлороформ — метанолом, последние не должны давать окрашивания, обусловленного присутствием липидов.

ПРИМЕЧАНИЯ

Можно также использовать замороженные срезы тканей, фиксированных в формалине. Перед экстракцией ацетоном срезы следует подсушить. Продолжительность экстракции в хлороформ — метаноле для материала, фиксированного в формалине, должна составлять 1—2 ч. С помощью обработки срезов NaOH после экстракции ацетоном удается выявлять сфингомиелин. Плазмалогены можно удалять при помощи гидролиза в 1% HgCl2 или в 1% HgCl2 в 1 н. НС1 в течение 10 мин. Преимуществом этого метода являются быстрота и надежность.

168 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

МЕТОД С ПРИМЕНЕНИЕМ ЧЕТЫРЕХОКИСИ ОСМИЯ а-НАФТИЛАМИНА (Os04-HA-METOfl) ПО АДАМСУ (ADAMS)

МЕТОДИКА

1. Фиксация ткани в кальпий-формоле, приготовление замороженных срезов толщиной 10—15 мкм.

2. Обработка свободноплавающих срезов в следующей смеси: 1 часть 1% Os04, 3 части 1% КСЮ3—18 ч.

3. Промыть в дистиллированной воде, 10 мин.'

4. Срезы монтировать на покровные стекла.

5. Обработать насыщенным водным раствором а-наф-тиламина при +37° С, 10—20 мин (насыщенный раствор а-нафтиламина готовится путем добавления ос-нафтилами-на к дистиллированной воде и последующего фильтрования после нагревания до +40° С).

6. Промыть в дистиллированной воде, 5 мин.

7. Окрашивание 2%-ным альциановым синим в 5%-ной уксусной кислоте, от 15 до 60 с (под контролем микроскопии!).

8. Заключение в глицерин —желатину.

РЕЗУЛЬТАТ

Фосфолипиды окрашиваются в оранжево-красный цвет, эфиры холестерина и триглицериды—в черный.

ПРИМЕЧАНИЯ

Гидрофобные липиды, окрашенные в черный цвет, во многих случаях могут маскировать имеющиеся в тканях фосфолипиды. В результате гидролиза свободноплавающих замороженных срезов в 2 н. NaOH, 1 ч при +37° С, глицерофосфолипиды вымываются, а устойчивые к действию щелочи сфингомиелины сохраняются и окрашиваются в оранжево-красный цвет. Этот метод выявления надежен лишь при условии предварительной фиксации срезов в абсолютном ацетоне.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 169

РЕАКЦИЯ ШУЛЬЦА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА И ЕГО ЭФИРОВ (WEBER, С ИЗМЕНЕНИЯМИ)

МЕТОДИКА

1. Фиксация кусочков тканей в кальций—формоле, 2— 3 дня в холодильнике.

2. Приготовление замороженных срезов толщиной 20—30 мкм.

3. Свободноплавающие срезы промыть в нескольких сменах дистиллированной воды, 24 ч.

4. Поместить срезы в забуференный раствор сульфата железо(Ш)-аммония, 7 дней при + 37°С [2,5%-ный сульфат железо(Ш)-аммония (фиолетовые кристаллы) в 0,2 М ацетатном буфере, рН 3,0; окончательная величина рН раствора около 2,0].

5. Замороженные срезы промыть в ацетатном буфере, 3 х 1 ч.

6. Промыть в дистиллированной воде.

7. Перенести в 5%-ный формалин, 10 мин.

8. Срезы из раствора формалина нанести на предметные стекла, затем осторожно дать жидкости стечь, после чего просушить фильтровальной бумагой.

9. Нанести на покровное стекло одну каплю смеси уксусной и серной кислот (смесь из равных частей химически чистых уксусной и серной кислот); серную кислоту осторожно по каплям добавлять к уксусной кислоте! (при этом колбу лучше всего охлаждать в ледяной бане). Перевернутое предметное стекло со срезом осторожно положить на покровное и слегка прижать так, чтобы жидкость равномерно распределилась по срезу.

10. Сразу же исследовать под микроскопом.

РЕЗУЛЬТАТ

Холестерин и его эфиры через несколько секунд приобретают сине-зеленое окрашивание. Через 30—60 мин цвет меняется на синий. Хотя при помощи реакции Шульца выявляются не только холестерин и его эфиры, метод можно считать достаточно специфичным. Выявление различий между холестерином и его эфирами возможно в реакции с дигитонином по Фейгину (Feigin, 1956).

170 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ВЫЯВЛЕНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ПО ХОЛЬЦИНГЕРУ (HOLCZINGER, 1959)

МЕТОДИКА

1. Приготовление замороженных срезов нефиксированного материала.

2. Обработка срезов 0,005%-ным водным раствором ацетата меди, 3—5 ч.

3. Промыть в двух сменах 0,1%-ного раствора двуна-триевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭД-ТУК) при рН 7,1 по 10 с.

4. Промыть в дистиллированной воде.

5. Срезы обработать в 0,1%-ной рубеановой кислоте в 70%-ном этаноле (100 мг рубеановой кислоты растворить в 70 мл абсолютного этанола при легком нагревании). После охлаждения раствор довести до 100 мл дистиллированной водой, 30 мин.

6. Промыть в 70%-ном этаноле, несколько мин.

7. Промыть в дистиллированной воде.

8. Окрасить ядерным прочным красным (в случае необходимости).

9. Заключить в глицерин — желатину или обезводить в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Жирные кислоты окрашиваются в зеленовато-черный цвет.

ПРИМЕЧ

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(05.07.2020)