|
|
Основы гистохимиилезным гематоксилином в деталях еще не выяснен, но предполагается, что в окрашивании играет роль катионный хелат, обладающий способностью связывать ионы железа с фосфатными группами. При менее специфичном методе с фталоцианином меди по Клюверу и Баррере (Kliiver, Ваггега) происходит связывание красителя с остатком холина в фосфолипидах. Предполагается, что в спиртовых р/астворах реакция протекает согласно следующему механизму: // . Фталоцианин меди R-0-P-0 чоснгснгЫ(СНз13 + iCuPOSOsH- Основание—*-о R-О-Р-0 ОСНгСН2М(СНз)э03$(СиРС) + Основание Люксоловый прочный синий ARN и люксоловый прочный синий G образуют комплексы с фосфолипидами в 0,1%-ных растворах в абсолютном этаноле. Сравнительно низкая специфичность окрашивания люксоловыми красителями компенсируется их значением для обзорных ней-рогистологических исследований. 4. Гистохимия отдельных классов веществ и Ферментов 157 2. НЕНАСЫЩЕННЫЕ ЛИПИДЫ Для выявления ненасыщенных липидов пригоден метод четырехокись осмия-а-нафтиламин (Os04-HA) по Адамсу (Adams) в сочетании со вспомогательными реакциями. В этой реакции гидрофобные липиды в результате окисления 0s04 до Os02 окрашиваются в черный цвет, тогда как гидрофильные липиды, образуя хелатные комплексы с осмий — нафтиламином, окрашиваются в красный цвет. При помощи этого метода можно различать 3 типа липидов: а) ненасыщенные гидрофобные липиды (черный цвет), б) ненасыщенные гидрофильные липиды (красный цвет) и в) насыщенные липиды (бесцветные). При помощи метода хром — серебро по Нортону (Norton) происходит образование галогенидов серебра и их восстановление до металлического серебра с помощью фотопроявителя. 3. КИСЛЫЕ ЛИПИДЫ Из приведенных в табл. 33 методов наиболее надежным следует считать метод установления базофилии с помощью забуференных растворов метилового синего для отграничения от кислых мукоидных веществ и нуклеиновых кислот. Выявление кислых липидов, кроме того, воз-" можно при помощи нильского синего. 4. ФОСФОГЛИЦЕРИДЫ - Принцип, лежащий в основе метода с образованием гидроксамата золота, основан на гидроксиламинолизе жирных кислот. Образующиеся при этом гидроксамовые кислоты выявляются путем восстановления серебром и последующего их перевода в гидроксамат золота. Фосфогли-цериды окрашиваются в цвета от стабильного красного до пурпурно-красного. 5. СФИНГОМИЕЛИН Сфингомиелин относится к липидам, устойчивым к действию щелочей. Довольно специфично сфингомиелин выявляется путем гидролиза с NaOH в сочетании с 158 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов ОвО^НА-реакцией, методом Элледера—Лойды и пробой с кислым гематеином. 6. ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ В основе гистохимического выявления свободных жирных кислот лежат два принципа: а) омыление с помощью солей металлов; б) образование солей красителей в реакциях жирных кислот с некоторыми основными красителями. Среди методов, основанных на омылении—методы Фишлера (Fischler), Окамото (Okamoto), Уэда (Ueda) и Като (Kato) и др.—наиболее надежные результаты обеспечивает метод Хольцингера (Holczinger, 1959). В этом методе жирные кисдоты окрашиваются с помощью комплексного соединения (рубеановая кислота—медь) в зеленовато-черный цвет. Важной предпосылкой для получения надежных результатов является использование нефиксированных замороженных срезов свежего материала. 7. ХОЛЕСТЕРИН Из методов гистохимического выявления холестерина своей высокой специфичностью выделяется метод Адамса (Adams, 1961) с хлорной кислотой и нафтохиноном (ХКН-метод). Достаточной гистохимической специфичностью обладает окислительный метод Шульца (табл. 33) с железными квасцами. Выявление холестерина В методе с хлорной кислотой и нафтохиноном хлорная кислота образует с холестерином нерастворимый хлорат. 4. Гистохимия отдельных классов веществ и Ферментов 159 При избытке хлорной кислоты эта соль теряет одну молекулу воды. При этом образуется холеста-3,5-диен. В последующей реакции с 1,2-нафтохинон-4-сульфоно-вой кислотой образуется темно-синий пигмент. 8. ПЛАЗМАЛОГЕН Впервые гистохимическое выявление плазмалогена провели Фёльген и Фойт (Feulgen, Voit, 1924) при помощи разработанной ими так называемой плазмалевой реакции. Впоследствии этот метод неоднократно модифицировался. По-видимому, плазмалевая реакция достигает максимальной интенсивности лишь при использовании ионизированных соединений ртути; при этом ртуть встраивается в структуру плазмалогена. Этот же принцип реакции был использован в плазмалевой реакции Хайеса (Hayes, 1949). При этом в результате непродолжительного воздействия сулемы на плазмалоген отщепляются высшие альдегиды, которые становятся видимыми под действием реактива Шиффа. 9. ВЫЯВЛЕНИЕ СВЯЗАННЫХ, ИЛИ МАСКИРОВАННЫХ, ЛИПИДОВ Липиды, существующие в тканях в невидимой форме, объединяются термином «маскированные липиды». Некоторые из них принимают участие в построении основной ' структуры цитоплазмы или находятся в клетке в виде мельчайших диспергированных коллоидных частиц. Особенно характерно образование липидами комплексов с белками. Связывание липидов с углеводами наблюдается реже. В результате связывания маскированных липидов, прежде всего с белками, их прямое выявление оказывается невозможным. Для гистохимического выявления маскированных липидов должны быть выполнены два условия: объединение мелкодиспергированных липидов в большие по размерам комплексы и разрушение связи липид — — белок. В методе Беренбаума (Berenbaum, 1958) с использованием Судана черного В в ацетоне связанные (маскированные) липиды (хроматин, ядрышко и др.) окрашиваются в цвета от темно-серого до черного. Для установления ли- 160 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов пидной природы окрашиваемых структур необходимо проводить контрольные опыты с экстракцией. 10. ВЫЯВЛЕНИЕ КЕТОСТЕРОИДОВ Гистохимическое выявление кетостероидов основано на замещении кетогрупп фенилгидразином (или динитро-фенилгидразином) с образованием окрашенных гидразо-нов: R • C = 0 + H2N • NH с-он 4NH • NH C=N с6н5 Поскольку образование гидразонов возможно и при наличии в исследуемом материале альдегидных групп, гистохимические методы выявления кетостероидов нельзя считать специфичными. Эти ограничения распространяются и на метод выявления кетостероидов по Ашбелю и Зе-лигману (Ashbel, Seligman, 1949). В этом методе гидразид 2-окси-З-нафтойной кислоты конденсируется с кето- и альдегидными группами и образует гидразоны, которые в результате сочетания с солью диазония (прочный синий В), образуют азокраситель: .он .он // <\ г.....- /R' JT\ Pi • NH N [H2+0*C-R -f_V-C0NH • N=C-R R4 R-C=N HNCO OH HO C0NHN=C-R Продукт азосочетания 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 161 11. ВЫЯВЛЕНИЕ КАРБОНИЛЬНЫХ ГРУПП Перечень реакций для выявления карбонильных групп приведен в табл. 34. В сочетании с реакциями иодирования может быть достигнута достаточная специфичность выявления Таблица 34 Методы выявления карбонильных групп (Gedick, Totovic) Фиксация Заливка Реакция Окрашивание Специфичность Ф; Ф-Са| ф; Са-Ф Ф; Са-Ф Ф; Са-Ф П 3 Шифф Аммиачный раствор серебра (ме-тенамин-сереб ро) Нафтойная кислота и гидразид Фенил-гидразин-формазан Красно-фиолетовое Коричнево-черное Сине-фиолетовое От красного до красно-коричневого Преимущественно альдегиды,неко-торые кетоны То же Только альдегиды г4.4.3.4. ВЫЯВЛЕНИЕ ЛИПИДОВ НА ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКО-¦"ПИЧЕСКОМ УРОВНЕ Ультрагистохимия липидов находится еще в начальной фазе своего развития. Особенно трудно обеспечить сохранность липидов в процессе фиксации и последующей обработки фиксированного материала. Количественные исследования свидетельствуют о том, что дофиксация в Os04 лишь частично предотвращает потери вещества. Осмиро-вание оказывает стабилизирующее действие главным образом на ненасыщенные липиды. Связанный осмий значительно усиливает контрастирование структур. Этот факт играет, однако, лишь незначительную роль в идентификации липидов, поскольку Os04 образует электроноплотные соединения и с другими веществами. В табл. 35 представлен перечень ультрагистохимических методов выявления липидов. .6-235 Таблица 35 Ультрагистохимическое выявление'липидов (Geyer, с изменениями) Выявляемые липиды Метод Авторы Примечания Триглицериды Фосфоглицериды Холестерин Ферментативное отщепление жирных кислот Реакция образования гидроксамовых кислот Реакция холестерин-ди-гитонин Adams, Abdulla, Bayliss, Weller (1966) Gallyas (1963); Weller, Bayliss, Abdulla, Adams, (1965) " Scallen, Dietert (1969) Специфичность метода зависит от чистоты препарата липазы Положительно реагируют гидрофильные фосфоглицериды и гидрофильные триглицериды с очень короткими цепями; продуктом реакции являются крупные электроноплот-ные гранулы серебра Реакция сопровождается некоторым смещением выявляемого вещества 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 163 4.43.5. МЕТОДЫ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ОКРАШИВАНИЕ СУДАНОМ ЧЕРНЫМ В ПО ЛИЗОНУ (LISON, 1960) МЕТОДИКА 1. Фиксация в кальций—формоле, замороженные срезы или заливка в поливакс. 2. Промыть в 70%-ном этаноле. 3. Окрасить Суданом черным В (насыщенный раствор Судана В в 70%-ном этаноле перед использованием фильтровать!), 20—30 мин. 4. Промыть в 70%-ном этаноле, 30 с. 5. Быстро промыть в дистиллированной воде. 6. Окрасить 1%-ным ядерным прочным красным, 1 мин. 7. Быстро промыть в дистиллированной воде и заключить в глицерин — желатину или в глицерин по Целлеру. РЕЗУЛЬТАТ Липиды окрашиваются в цвета от черного до темно-синего, ядра окрашиваются в красный цвет. Окрашиваются также и фосфолипиды. ПРИМЕЧАНИЯ Для контроля неспецифического окрашивания за счет адсорбции можно воспользоваться экстракцией ацетоном или этанолом. ОКРАШИВАНИЕ МАСЛЯНЫМ КРАСНЫМ О В ИЗОПРОПАНОЛЕ ПО ЛИЛЛИ (LILLE, 1944) МЕТОДИКА 1. Фиксация в кальций—формоле, замороженные срезы. 2. Замороженные срезы поместить в дистиллированную воду и быстро промыт |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 |
Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |