Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

с-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 149

пользовании флуоресцентных красителей (так называемые флуорохромы).

а) МЕТОДЫ ПЕРВИЧНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

В гистохимии липидов первичная флуоресценция наблюдается лишь у липопигментов (от желтой до желто-зеленой), липидов с растворенным каротином (зеленая флуоресценция в УФ-лучах) и стероидных гормонов (зеленая флуоресценция, изменяющаяся во времени). Представляет интерес метод выявления витамина А.

б) МЕТОДЫ ВТОРИЧНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Эти методы позволяют точнее устанавливать присутствие липидов в клетках и тканях, чем обычные методы с использованием красителей. Но еще важнее то, что с помощью флуорохромирования Липиды и липопротеиды выявляются даже в низких концентрациях. Это особенно относится к флуорохромированию бензпиреном. С помощью фосфина 3R удается получить серебристо-белую флуоресценцию липидов, которая четко выделяется на фоне общей флуоресценции ткани. Оба метода отличаются тем, что флуоресцентные красители могут использоваться в водных растворах без растворения мельчайших капель жира.

4.4.3.1.4. ОКРАШИВАНИЕ ЖИРОРАСТВОРИМЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ

С помощью жировых красителей выявляются только липиды- Окрашивание липидов так называемыми жировыми красителями, согласно Михаэлесу, представляет собой обычный процесс растворения, т. е. процесс физический, а не химический. В конечном счете окрашивание липидов обусловлено лучшей растворимостью красителя в липидах по сравнению с его растворимостью в исходном растворителе. Поскольку окрашивание жиров представляет собой физический процесс, избирательное окрашивание отдельных липидов в соответствии с их химическим составом практически невозможно. Для всех жировых красите-

150 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

лей единственным общим признаком является отсутствие солюбилизирующих сульфо (— S03H)- или карбоксильных (—СООН)-групп (Harms, 1957).

Основными представителями подобных жировых красителей являются суданы и их различные варианты (табл. 32).

Таблица 3.

Методы окрашивания липидов, применяемые в световой микроскопии (Gedigk Totovic, с изменениями)

Краситель Раствор Авторы

Судан IV Судан IV Судан черный В Судан черный В Судан черный В Масляный красный О Различные суданы Шарлаховый красный Судан ГП Судан III, IV 70%-ный этанол или раствор Герксхаймера 55-70%-ный этанол 35%-ный трет-бутанол 50%-ный диацетин 65%-ный изопропанол Пропиленгликоль 55%-ный диацетин Этанол-фенол-уксусная кислота Уксусная кислота-желатина Kay, Whitehead, 1941 [in Pearse, 1968) Lison (1960) Lison, Hadler, Sampaio (Lison, 1960) Leach (1938) Lillie (1944) Chifelle, Putt (1951) Gross (1930) Jackson (1944) Govan (1944)

По сравнению с часто применявшимися ранее красными диазокрасителями Суданом III и Суданом IV введенный Лизоном в практику гистохимии судан черный В обладает лучшими красящими свойствами. Он, однако, имеет и существенный недостаток—способен окрашивать белки и мукополисахариды. По своей химической структуре Судан черный В является диметилнафталинпиримидин-4-азо-(1-нафтил)-4-азобензолом

N=N

Судан черный В

Помимо судана черного, интенсивное окрашивание жиров, в том числе и мельчайших жировых капель, достигает-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 151

ся при помощи масляного красного О и особенно масляного красного 7 В:

Результаты окрашивания определяются не только свойствами красителя, но и используемым растворителем (см. табл. 32). На практике хорошо себя зарекомендовала смесь Герксхаймера, состоящая из равных частей 70%-ного этанола и ацетона, которая растворяет жиры клетки лишь в незначительной степени. Экстракцию липидов можно полностью предотвратить использованием коллоидных растворов—например, растворы Джексона (Jackson) или Гована (GovanJ.

4.4.3.2. МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРАСИТЕЛЯ

К этой категории принадлежит метод выявления нейтральных и кислых липидов с использованием нильского синего. Двойственное его поведение при окрашивании водными растворами объясняется следующим образом: не-диссоциированный краситель (нильский красный) растворяется в липидах, а диссоциированный (нильский синий), наоборот, в липидах не растворяется, но связывается с кислыми группами липидов и различными другими компонентами ткани посредством электростатических сил. Метод окрашивания нильским синим обладает низкой чувствительностью, причем особенно синий компонент его склонен к неспецифическим реакциям.

4.43.3. ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИПИДОВ

Для выявления липидов помимо физических методов используются методы, основанные на химических реакциях. К этой группе принадлежит большая часть гистохимических методов выявления липидов (табл. 33).

снэ

он

Масляный красный О

Таблица 33

Методы выявления липидов и липопротеидов

Выявляемый липид Фиксация11 Тип среза" Реакция Результаты (окрашивание) Специфичность Примечание*

Фосфоли- Са-Ф 3 Хромирование Черное (сине- Не абсолютная С

пиды (проба с кислым гематеином) черное)

Фосфоли- Са-Ф и 3, п Окрашивание фта- Синее Неспецйфична, необхо- О

пиды Др- лоцианином меди (люксоловый прочный синий) димы контроли Фосфоли- Ф 3 Окрашивание же- Темно-синее Специфична с экстрак- С, О

пиды лезным гематоксилином цией в контроле

Фосфо- и Различ- п Окрашивание фта- Синее Неспецифична О

глико- ные лоцианином

липиды фиксаторы меди

Гликоли- То же 3, п ШИК Красное Неспецифична, необхо- О

пиды димы контроли

Липопро- Са-Ф 3 Бензпирен - кофеин Синяя или голу- То же с

теиды (Berg) бовато-белая

флуоресценция

Ненасы- 3, п OsO-HA 4 Черное Специфична лишь со с, О

щенные вспомогательными ре-

липиды акциями

Ненасы- 3, п Четырехокись ос- Черное (сине- Неспецйфична, необхо- С, О

щенные мия черное) димы контроли

липиды

Продолжение табл. 33

Выявляемый липнд Фиксация" Тип среза1* Реакция Результаты (окрашивание) Специфичность Примечание2'

Сфинго- 3 NaOH-OsO-HA 4 Оранжево-крас- Достаточно специфична С, О

миелин ное для сфингомиелина в

сочетании с экстрак-

цией ацетоном

Сфинго- 3 NaOH-гематеин" Сине-черное Цереброзиды окрашива- С, О

миелин ются очень слабо

Жирные » к Медь - рубеановая Зелен овато-ч ер- Специфична С,0

кислоты кислота ное

Холесте- Ф 3 ХКН (хлорная кис- Синее Синее окрашивание спе- С, О

рин Са-Ф лота -нафтохи- цифично для холесте-

нон) рина

Холесте- Ф-Са. 3 Метод окисления Сине-зеленое Достаточно специфична С, О

рин -Cd-Ф с использовани-

ем железных

квасцов

Плазмало- _ к ^ocnuuzj Плазмалевая реак- Красное На нефиксированных С,0

ген ция (Hayes) срезах специфична

Двойные Са-Ф 3 Бром - серебро От коричневого Достаточно специфична; С, О

связи до черного низкая чувствитель-

ность

Двойные Этанол к УФ-Шифф Темно-красное Неспецифична, необхо- с

связи (не- димы контроли

про-

дол-

жи-

тель-

но)

Продолжение табл. 33

Выявляемый Фиксация" Тип,, среза Результаты Примечание2)

липид Реакция (окрашивание) Специфичность Кислые Са-Ф 3 Базофилия Связывание ме- Неспецифична, необхо- С

липиды тиленового синего при рН ниже 4 димы контроли

Кислые Са-Ф К Окрашивание при Красное Неспецифична, необхо- СО

липиды (непро- заключении димы контроли

дол- (Feyrter)

жи-

тель-

Кислые но Без фик- к Кислый солохром- Темно-синее в Неспецифична, необхо- С

липиды цианин кислом

растворе кра- димы контроли

сации сителя (рН

или 2,1)

не-

про-

дол-

жи-

тель-

но

фик-

сиро-

ван -

ные в

эта-

но-

ле3)

Продолжение табл. 33

Выявляемый липид Фиксация" Тип среза Реакция Результаты (окрашивание) Специфичность Примечание21

Липиды, Ф 3 АЦАК-реакция Фиолетовое Специфична (возможно С

содер- (ангидрид цис- вымывание различных

жащие аконитовой кис- липидов)

холин лоты)

Фосфогли- Са-Ф 3 Гидроксамат золо- Темно-красное Специфична для лецити- С, о

цериды та на и кефалина

"Сокращения: Ф-формалин; Са-Ф - кальций-формол; Ca-Cd-Ф - кальций-кадмий-формол; П - парафиновые срезы; 3 - замороженные сре->ы; К - криостатные срезы.

' О-для обычных исследований, С-для специальных исследований. ' Уксусная кислота-этанол.

156 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

4.4.3.3.1. ПРИНЦИПЫ РЕАКЦИЙ /. ФОСФОЛИПИДЫ

Из перечисленных в табл. 33 методов выявления фосфолипидов следует отметить пробу с кислым гематеином и метод с железным гематоксилином по Элледеру и Лойде (Elleder, Lojda) вследствие их достаточно высокой специфичности. Проба с кислым гематеином основана на окислении фосфолипидов хромированием. Связывающийся с фосфолипидами хром переводится с помощью кислого гематеина в соединение хром — гематеин темно-синего цвета. Диагностическое значение имеет лишь темно-синее окрашивание.

Механизм реакции при окрашивании же

страница 23
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.05.2019)