Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

Сент-Дьёрди, отметившего, что кора надпочечника способна восстанавливать растворы нитрата серебра. Принцип реакции заключается в обработке срезов сильно подкисленными растворами нитрата серебра; восстановленная форма аскорбиновой кислоты восстанавливает часть нитрата серебра. Невосстановленное серебро удаляется из препарата промыванием. Окисленная форма аскорбиновой кислоты не восстанавливает нитрат серебра. Исходя из этих соображений, срезы перед обработкой нитратом серебра подвер-

_4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 129

гают восстановлению с помощью H2S.

Аскорбиновая кислота Дегидроаскорбиновая киста (восстановленная форма) (окисленная дюрма)

Однако, по-видимому, эта процедура не ведет к увеличению выявляемых в срезах отложений серебра. Из существующих гистохимических реакций выявления аскорбиновой кислоты Пирс рекомендует методы Барнета и Бурна (Barrnett, Bourne, 1941), Бакхуса (Bacchus, 1950) и Йенсена и Кавальяна (Jensen, Kavaljian, 1956).

Методы выявления аскорбиновой кислоты с помощью солей серебра имеют следующие недостатки:

а) опасность смещения продукта, вызываемого прежде всего применением уксусной кислоты, которая проникает в срез быстрее, чем нитрат серебра; б) восстановление других веществ нитратом серебра (например, некоторых липидов, фосфата, меланина); в) адсорбция ионов серебра на различных структурах.

4.3.3. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ

Для идентификации полисахаридов и полисахарид-белковых комплексов на ультраструктурном уровне можно использовать целый ряд проверенных методов, большая часть из которых основана на реакции окисления йодной кислотой (табл. 31). Выявление альдегидов, образованных в результате окисления йодной кислотой, может проводиться различными способами. Пирс (Pearse, 1972) выделяет три основных подхода:

1. Применение солей серебра. 2. Применение тиосеми-карбазидов и сходных реакций. 3. Флуорометрия с применением арилгидразина.

Выявление свободных моно- и олигосахаридов наталкивается на ряд трудностей, хорошо известных еще по световой микроскопии.

сн2он он-с-н

СН20Н

но-с-н

5-235

Таблица 31

Электронно-микроскопическое выявление углеводов

Вещества Методы Авторы j Примечания

Гликоген Крахмал Мукоидные вещества, реагирующие с йодной кислотой Контрастирование гликогена Контрастирование гликогена кармином Беста Контрастирование иодом и цитратом свинца Йодная кислота - хромовая кислота - метенамин - серебро Реакция йодная кислота -тиокарбогидразид - Os04 (ИКТО-реакция) ИКТО-реакция ¦% Реакция йодная кислота -тиокарбогидразид - протеи-нат серебра (ИКТС-про-теинат-реакция) Perry (1967) Themann (1960, 1963) Flood (1970) Rambourg, Hernandez, Leblond (1969) Hanker u. Mitarb. (1964) Seligman u. Mitarb. (1964, 1965) Thiery (1967) Интенсивное контрастирование гликогена цитратом свинца особенно хорошо удается после окисления йодной кислотой В качестве агентов, восстанавливающих Os04 (образование осмиевой черни), помимо тиокарбазида можно использовать тиосеми-карбазид Помимо нейтральных и кислых мукоидных веществ контрастируется также гликоген; протеинат серебра можно заменить протарголом

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 131

4.3.4. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ УГЛЕВОДОВ ШИК-РЕАКЦИЯ ПО МАК-МАНУСУ

МЕТОДИКА

1. Фиксация: забуференный формалин, формалин — — цетилпиридиниевый хлорид, Россман, Карнуа, Ценкер; заливка в парафин.

2. Депарафинированные срезы поместить в дистиллированную воду.

3. Срезы при комнатной температуре окислять 0,5—1%-ным водным раствором йодной кислоты (Н5Ю6, НЮ4), 10 мин.

4. Промыть в проточной воде, 10 мин.

5. Поместить в дистиллированную воду, 2x2 мин.

6. Поместить срезы в реактив Шиффа, 15—30 мин при комнатной температуре. [Реактив Шиффа по Грауманну: 0,5 г парарозалина (парафуксин, свободный от акридина, стандартный) полностью растворить в 15 мл 1 н. НС1 без нагревания при помешивании и довести до 85 мл дистиллированной водой с растворенными в ней 0,5 г метаби-сульфита калия (K2S2Os); прозрачный интенсивно-красный раствор, будучи помещенным в темноту в сосуде с плотной пробкой, в течение 24 ч приобретает желтоватый цвет; его встряхивают 2 мин с 0,3 г активированного угля (порошок) и затем дважды фильтруют. Такой раствор готов к употреблению и может храниться в сосудах коричневого цвета с пришлифованной пробкой по крайней мере 2 мес.]

7. Срезы промыть 802-водой (600 мл дистиллированной воды, 30 мл 10% K2S2Os, 30 мл 1 н. НС1), 3x2 мин.

8. Тщательно промыть в проточной и дистиллированной воде.

9. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

После п. 8 можно провести окраску ядер (кислый гемалаун по К. Майеру, 45 с).

РЕЗУЛЬТАТ

Мукоидные вещества, содержащие гексозу, окраши-

132 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ваются в красно-лиловый цвет. Гликоген приобретает более интенсивное окрашивание.

КОНТРОЛЬ

Расщепление гликогена, реакция ацетилирования для блокирования гидроксильных групп.

ПРИМЕЧАНИЯ

Для выявления водорастворимых веществ Хочкисс (Hotchkiss) предложил использовать спиртовый раствор йодной кислоты следующего состава: 0,4 г йодной кислоты, 35 мл этанола, 5 мл ОД М (2,72%) ацетата натрия. Этот раствор йодной кислоты окисляет медленнее, чем соответствующий водный раствор. Для окисления таким раствором при комнатной температуре требуется 1 — 2 ч. По данным Барки (Вагка), после фиксации гликоген остается устойчивым к действию водных растворов.

Предложенное Хочкиссом промывание восстанавливающей жидкостью для удаления иодатов после окисления йодной кислотой ведет к образованию соединений между бисульфитами и альдегидами, которые неблагоприятно влияют на заключительную реакцию альдегидов с реактивом Шиффа.

R С'( + NaHSOs —»* R CrSOjNo

Иодаты можно удалить из срезов и простым тщательным промыванием в проточной воде.

МЕТОД С ЙОДНОЙ КИСЛОТОЙ И ПАРАДИАМИНОМ (ИКП-МЕ-ТОД) ПО СПАЙСЕРУ (SPICER, 1966)

МЕТОДИКА

1. Фиксация в одной из сред, используемых для выявления углеводов, заливка в парафин.

2. Депарафинированные срезы довести до воды.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 133

3. Окисление в 1%-ном водном растворе йодной кислоты, 10 мин.

4. Промывание в проточной воде, 10 мин.

5. Срезы обработать в растворе парадиамина, 7, 24 или 48 ч. рС 50 мл цитрат — фосфатного буфера (4,8 мл 0,1 М лимонной кислоты; 7,2 мл 0,2 М двузамещенного фосфата натрия; 38 мл дистиллированной воды) добавляют непосредственно перед употреблением 50 мг N,N-flHMera!i-п-фенилендиамина—HC1.J

6. Дифферештровать в 1% НС1 в 70%-ном этаноле 8 с после окрашивания в течение 24 ч или 10 с после окрашивания в течение 48 ч.

7. Промыть в воде, 5 мин.

8. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Нейтральные мукополисахариды окрашиваются в коричневый цвет; иодат-реактивные полимеры окрашиваются в темно-красный или серо-коричневый цвет; мукоидные вещества, которые не реагируют с йодной кислотой, окрашиваются в черный цвет.

ВЫЯВЛЕНИЕ КИСЛЫХ МУКОПОЛИСАХАРИДОВ С ПОМОЩЬЮ КОЛЛОИДНОГО ЖЕЛЕЗА; МОДИФИКАЦИЯ РЕАКЦИИ ХЭЙЛА ПО ГРАУМАННУ И КЛАУСУ (GRAUMANN, CLAUS, 1958)

МЕТОДИКА

1. Фиксация: забуференный формалин, Карнуа, формалин — этанол, формалин — цетилпиридин (4%-ный формалин + 0,5%-ный N-цетилпиридинийхлорид), Жандр, заливка в парафин; срезы без фиксации или криостатные срезы, фиксированные в смеси Вольмана (5 мл ледяной уксусной кислоты + 95 мл абсолютного этанола) также позволяют получать хорошие результаты.

2. Срезы депарафинировать и через ряд спиртов убывающей концентрации довести до дистиллированной воды. Обработка свежих криостатных срезов начинается

134 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

с п. 3. Фиксированные срезы хорошо промыть в дистиллированной воде.

3. Поместить срезы на 10 мин в коллоидньш раствор железа, подкисленный уксусной кислотой: маточный раствор—10 частей, 96—99%-ной уксусной кислоты—4 части. (Маточный раствор: 750,0 мл дистиллированной воды довести до кипения и добавить 12,0 мл 32%-ного раствора хлорида железа (III). Образовавшаяся гидроокись железа может храниться в течение месяца.)

4. 5%-ная уксусная кислота, 2x5 мин.

5. Срезы поместить в следующий, свежеприготовленный раствор (реакция берлинской лазури): 30 мл 2%-ного гексацианоферрата (II) калия + 60 мл 1%-ной НС1,10 мин.

6. Дистиллирования вода, 2x2 мин.

7. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Структуры, в которых содержатся кислые мукополиса-хариды, окрашиваются в синий цвет.

ПРИМЕЧАНИЯ

Специфичность метода Хэйла для выявления кислых мукоидных веществ следует контролировать с помощью вспомогательных реакций. Ложную положительную реакцию, обусловленную присутствием железа в тканях, можно исключить путем обработки контрольных срезов в растворе гексацианоферрата (II) калия и НС1 (этап 5 данного метода). По Иммерсу (Immers, 1954), реакция Нэйла специфична для выявления свободных кислотных групп, например для эфиров серной и фосфорной кислот, свободных гидроксильных групп уроновой и моноаминоди-карбоновых кислот белков. По данным сравнительного исследования Грауманна (Graumann, 1958) модификация метода Хэйла по Мюллеру (1955) особенно пригодна для выявления кислых веществ матрикса в клетке.

Благодаря предложенной Грауманном (1959) модификации реакции Хэйла с коллоидным раствором железа, подкисленным уксусной кислотой до рН 1,15, и с использо-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 135

ванием 5%-ной уксусной кислоты в качестве промывающего раствора вместо дистиллированной воды удается в значительной мере избежать образования нестабильных и неспецифических осадков железа, образующихся в недостаточно кислой реакционной среде.

Реакцию связывания железа можно комбинировать с ШИК-реакцией. В этом случае после п. 6 следует окисление йодной кислотой. В результате кислые мукоидные вещества окрашиваются в темно-синий цвет, белковые структуры—-в светл

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.12.2019)