Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

ды в гистохимии в настоящее время классифицируются как мукополисахариды (мукоидные вещества).

, Согласно Спайсеру и сотр. (Spicer u. Mitarb.) тканевые полисахариды делят, исходя из двух основных аспектов:

1) локализации выявляемых веществ,

2) характера реакции—нейтральные и кислые муко-вещества (сульфомуцин и сиаломуцин).

Такое разделение осуществляется на основании присутствия или отсутствия вицинальных гликолей, уроновых кислот, сульфатных групп и карбоксилов сиаловых кислот. Эти компоненты обозначаются буквами Г, У, Су, Си. Возможна и более подробная классификация углеводов в зависимости от их отношения к реакциям окрашивания. В табл. 23 дана классификация углеводов; приставка «му-ко», обычно используемая в гистохимии углеводов, здесь опущена.

Таблица 23

Классификация углеводов (Pearse, с изменениями)

I. Гликаны (полисахариды или олигосахариды)

а) Гомогликан (моносахаридный компонент)

Гликоген Крахмал Целлюлоза Декстран Галактан (Helix)

б) Гомоаминогликан Хитин

в) Гомогликуронан Пектиновая кислота Альгининовая кислота

г) Гетерогликаны (полисахаридные компоненты мукополисахаридов) Сиалогликаны

II. Протеогликаны

Кератансульфаты Гиалуроновая кислота Хондроитин-4-сульфат (хондроитинсульфат А) # Хондроитин-6-сульфат (хондроитинсульфат С)

Дерматансульфат (хондроитинсульфат В) Гепарин

Гиалуроновая кислота Хитин-белок

Группоспецифические антигены крови

III. Гликопротеиды и гликополипептиды Овомукоид

Мукоид слюнных желез (сиалогликопротеид) Гликопротеид сыворотки (включая иммуноглобулины)

IV. Гликолипиды Цереброзиды Ганглиозиды

V. Комплекс гликолипид-белок

Муколипид из мозга крупного рогатого скота Страндин

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 111

4.3.2. ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ УГЛЕВОДОВ

Гистохимические методы выявления углеводов можно разделить на методы окисления, метахроматическое окрашивание, связывание ионов металлов, реакции блокирования и превращения реакционноспособных групп, методы ферментативного гидролиза, а также методы радиоавтографии и иммуногистохимии полисахаридов. Центральное место среди этих методов занимает ШИК-реакция (реактив Шиффа — йодная кислота) для выявления полисахаридов.

43.2.1. МЕТОДЫ ОКИСЛЕНИЯ

43.2.1 Л. РЕАКЦИЯ ШИФФ - ЙОДНАЯ КИСЛОТА (ШИК-РЕАКЦИЯ)

Метод, предложенный Малапраде (Malaprade) в аналитической химии для выявления полиспиртов, впоследствии был с успехом модифицирован для гистохимических целей Мак-Манусом (McManus, 1946), Лилли (Lillie, 1947) и Хоч-киссом (Hotchkiss, 1948). Химическим субстратом окисления йодной кислотой являются а-гликоли, т. е. спирты, в которых соседние атомы углерода несут гидроксильные группы. Йодная кислота воздействует на обе гидроксильные группы а-гликолей и при расщеплении С — — С-связей в результате окисления образуются диальдегиды.

rch-Ov r сн-0\

r сн-о' r сн-о'

Гликодевые группы могут находиться в цис- или трансположении. Окисление ^^-ориентированных гидроксилов проходит быстрее, чем в случае транс-гидроксилов.

Помимо а-гликолей с йодной кислотой могут реагировать с образованием альдегидов также и карбонильные соединения (например, а-кетолы), а-аминоспирты и иногда этиленовые группы.

Из большого числа встречающихся в различных веществах а-гликолей положительную реакцию дают лишь те, в которых гидроксильные группы не замещены.

112 4. Гистохимия отдельных' классов веществ и ферментов

Согласно Хочкиссу, ШИК-реакция положительна при следующих условиях:

1. Выявляемые специфические группы (1,2-гликолевые, эквивалентные аминоалкиламино-производные, продукты окисления СНОН—СО) не должны быть замещены.

2. Вещества должны выдерживать фиксацию.

3. Продукт окисления йодной кислотой не должен обладать способностью к диффузии.

4. Должно быть достаточно много реакционноспособ-ных групп для взаимодействия с реактивом Шиффа.

При соблюдении перечисленных условий белки хотя и содержат остатки оксиаминокислот, не дают ШИК-реакции, поскольку реакционносцособные группы замещены пептидными связями и соответственно защищены от окисляющего действия йодной кислоты. Список основных веществ, дающих ШИК-реакцию на гистологических срезах, приведен в табл. 24.

Надежность ШИК-реакции в значительной мере определяется процессом окисления йодной кислотой. При концентрациях растворов йодной кислоты от 0,5 до .2,5% интенсивность реакции примерно одинакова. В гистохимической практике обычно используют 0,5о- 1%-ные растворы. Среди факторов, влияющих на интенсивность реакции, в первую очередь следует упомянуть продолжительность окисления и температуру, при которой проводится реакция. Повышение температуры всего на несколько градусов увеличивает скорость окисления и препятствует превращению 1,2-гликолей в диальдегиды под влиянием йодной кислоты. Поэтому ШИК-реакцию следует проводить при комнатной температуре. Продолжительность окисления йодной кислотой следует ограничить 10 мин, поскольку за это время а-гликоли и а-спирты в условиях гистохимической реакции практически полностью окисляются. При выявлении веществ, относящихся к группам I, II, III (табл. 24), эти условия необходимо соблюдать.

4.3.2.1.2. ОКИСЛЯЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ВМЕСТО ИОД-НОЙ кислоты

При гистохимическом выявлении углеводов вместо йодной кислоты можно использовать другие окисляющие

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов ИЗ

Таблица 24

ШИК-ооложительньк компоненты ткан (Pearse)

I. Полисахариды (гликаны)

П.

Аминогликаны и глюкуроно' аминогликаны

Ш. Гликопротеи-ды и глико-пептиды

IV. Гликолипиды

Ненасыщенные липиды н фосфолипиды

Мукоид слюнных желез, серо-мукоид, серогликоид, мукоид желудка, гонадотропный гормон хориона

Гонадотропные гормоны гипо физа, тиреотропный гормон гипофиза, группоспецифичес-кий антиген крови

Тиреоглобулин

Ганглиозиды ГКеразин

Цереброзиды )Френозин

Сфингомиелин

Гликоген Крахмал Целлюлоза Сиалогликан

Фракции: сывороточного альбумина сывороточного глобулина Коллаген

Инозитолфосфа-тиды

Липофусцин

Кардиолипин

Церонд

вещества. Наиболее часто используют ацетат свинца, хромовую кислоту, перманганат, висмутат натрия, ацетат натрия, арилиодацетат и фенилиодацетат.

Однако все эти вещества по своим окисляющим свойствам в условиях проведения гистохимических реакций уступают йодной кислоте. Прежде всего речь идет о недостаточной контролируемости окисляющего действия, что особенно относится к хромовой кислоте и перманганату, у которых обнаруживается тенденция к дальнейшему окислению образующихся альдегидных групп. Заслуживает рассмотрения механизм окисления ацетатом свинца, который обладает способностью окислять только те гидроксильные группы, которые находятся в i/uc-положении относительно друг друга, тогда как йодная кислота воздействует на гидроксильные группы, находящиеся в цис- и транс-положении.

114 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

В то время как тетраацетат свинца и йодная кислота ведут себя одинаково по отношению к 1,2-гликолям, тетраацетат свинца образует из а-аминоспиртов один, а йодная кислота два йодных радикала. а-Оксикислоты окисляются только тетраацетатом свинца с образованием альдегидных групп, но не окисляются йодной кислотой.

Методы окисления тетраацетатом свинца в сочетании с реактивом Шиффа (ТСШ-реакция) ведут к образованию тех же продуктов реакции, что и в случае окисления йодной кислотой (ШИК-реакция). Предполагается, что ТСШ-реакция в присутствии белков более специфична для полисахаридов, чем ШИК-реакция.

Хромовая кислота в качестве окисляющего агента особенно для выявления гликогена впервые была использована Бауером (Bauer). Поскольку эта кислота, подобно пер-манганату, имеет тенденцию окислять альдегидные группы далее до карбоксильных, продолжительным хромированием, а также повышением концентрации хромовой кислоты ослабляют интенсивность реакции. В отношении использования висмутата натрия, ацетата марганца и фенилацетата в качестве окисляющих агентов в гистохимии углеводов необходимы дальнейшие исследования.

4.3.2.1.3. ЙОДНАЯ КИСЛОТА - ПСЕВДО-ШИФФ-РЕАКЦИИ

Для выявления альдегидных групп, образовавшихся в результате окисления йодной кислотой, вместо фуксин-сернистой кислоты (реактив Шиффа) можно использовать основные красители из серии аминоакридинов в водных растворах, к которым добавляют минеральную кислоту и S02. Механизм взаимодействия этих реагентов с альдегидами отличается от механизма реакции Шиффа. Можно предположить, что псевдо-Шифф-реагенты помимо образовавшихся полиальдегидов выявляют также базофильные структуры, содержащие Р04- или S04-rpynmj (Stoward).

4.3.2.1.4. МЕТОДЫ ОКИСЛЕНИЯ ЙОДНОЙ КИСЛОТОЙ, В КОТОРЫХ ВМЕСТО ОСНОВАНИЯ ШИФФА ИСПОЛЬЗУЮТСЯ ДРУГИЕ РЕАКТИВЫ

В этих методах выявления мукоидных веществ в качестве окисляющего агента используется йодная кислота,

\

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 115

а для выявления образованных альдегидных групп вместо основания Шиффа используют гидразид салициловой кислоты, фенилгидразон, ариламин, парадиамин и др. Механизм реакции альдегид-фенилгидразонов с солями диазония представлен на следующей схеме:

2 R-CH=NNH

Фенилгидразон

Диазотированный ^ о-вианизидин

0СН3

ОСНз

О

Диоюрмазан (темно-красный )

4.3.2.2. КОНТРОЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧНОСТИ МЕТОДОВ ОКИСЛЕНИЯ

Специфичность методов, основанных на окислении йодной кислотой, особенно ШИК-реакции, можно контролировать путем ацетилирования реакционноспособных групп. Ацетилнрование блокирует реакционноспособные гидроксильные и аминогруппы полисахаридов. При этом способность к реакции теряют практически все ШИК-по-ложительные вещества. Поскольку двойные связи ненасыщенных жирных кислот в результате ацетилирования остаются неизменными и таким образом сохраняют свою способность окисляться, реакцию ацетилирования можно использовать для различения ШИК-положительных со-

116 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

единений, содержащих липиды и свободных от них. При обработке слабыми щелочами блокирование реакционно-спосо

страница 17
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.05.2019)