|
|
Основы гистохимиильные условия кислотного или ферментативного гидролиза Хорошая сохранность структуры и быстрое расщепление ДНКа-зой и РНКазой 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 103 2. Срезы депарафинировать и через ряд спиртов убывающей концентрации довести до воды. 3. Быстро промыть в холодной 1 н. НС1. 4. Срезы поместить при 60° С в 1 н. НС1 на оптимальное время гидролиза. 5. Быстро промыть в 1 н. НС1, а затем в дистиллированной воде. 6. Перенести в реактив Шиффа (стр. 131) на 45 мин. 7. Промыть в 3 сменах свежей 802-воды (5 мл 10% K2S2Os, 5 мл 1 н. НС1, дистиллированная вода до 100 мл), 3x2 мин. 8. Промыть в дистиллированной воде, 2 мин. 9. Возможна докраска 0,5%-ным светлым зеленым, 20 с. 10. Обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, ксилол, бальзам. РЕЗУЛЬТАТ Структуры, содержащие ДНК, окрашиваются в красно-лиловый цвет. После обработки дезоксирибонуклеазой реакция отрицательна. ПРИМЕЧАНИЯ В замороженных срезах реактив Шиффа окрашивает помимо ДНК и ацетальфосфатиды. Для проведения гидролиза вместо 1 н. НС1 можно использовать следующие реагенты: хлорную кислоту, трихлоруксусную кислоту, фосфорную кислоту, азотную кислоту, серную кислоту, ором. Интенсивность реакции Фёльгена можно оценивать количественно с помощью цитофотометрических измерений, поскольку при оптимальных сроках гидролиза реакция окрашивания альдегидных групп пропорциональна содержанию ДНК. Сопоставимые результаты можно получать при полном соблюдении постоянных условий опыта, таких, как способ фиксации, продолжительность и температура гидролиза, качество реактива Ши< фа, состав 802-воды. 104 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ДНК С ПОМОЩЬЮ БАО (RUCH, 1970) МЕТОДИКА 1. Фиксация в этаноле, этанолуксусной кислоте или формальдегиде. 2. Депарафинированные срезы, клетки или изолированные субклеточные частицы поместить в дистиллированную воду на 2 мин. 3. Срезы поместить при +60° С в 1 н. НС1 на оптимальное время гидролиза (8 — 12 мин). 4. Промыть в дистиллированной воде, 5 мин. 5. Окрасить БАО-раствором (100 мл 0,01% БАО-ра-створа, 10 мл 1 н. НС1, 5 мл 10% NaHSOA 2 ч. 6. Промыть в дистиллированной воде, 2 мин. 7. Промыть в растворе сульфита (180 мл дистиллированной воды, 10 мл 1 н. НС1, 10 мл 10% NaHS03), 3 х х 2 мин. 8. Промыть в проточной воде, 10 мин. 9. Обезводить в 50, 70, 95 и 100%-ном этаноле, по 30 с. 10. Просветлить глицерином или ксилилом, 2 х 30 с. 11. Заключить во флуормаунт. * 12. Исследовать в флуоресцентном микроскопе; фильтр УФ (UG1), пропускающий возбуждающий свет. РЕЗУЛЬТАТ Хроматиновые структуры дают яркую синюю флуоресценцию. ВЫЯВЛЕНИЕ ДНК И РНК МЕТИЛОВЫМ ЗЕЛЕНЫМ -ПИРОНИНОМ (МОДИФИКАЦИЯ KURNICK 1955) МЕТОДИКА 1. Фиксация 10%-ным забуференным формальдегидом, рН 7,0, 4—12 ч или по Карнуа, 4—24 ч при +4°С; заливка в парафин. 2. Депарафинированные срезы довести до дистиллированной воды. 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 105 3. Окрасить срезы в смеси метилового зеленого—ш*-ронина, 6 мин при температуре от +18 до + 24°С. (Смесь метилового зеленого с пиронином: 12,5 мл 2%-ного пи-ронина GS (Chroma), 7,5 мл 2%-ного метилового зеленого (Fluka), 30 мл дистиллированной воды.) 4. Просушить фильтровальной бумагой. 5. Дифференцировать в н-бутаноле, 2x5 мин. 6. Просветлить в ксилоле, 3x5 мин. 7. Заключить в нейтральный бальзам. РЕЗУЛЬТАТ Структуры, содержащие ДНК, окрашиваются в голубовато-зеленый цвет, а содержащие РНК—в красный. КОНТРОЛЬ Предварительная обработка срезов рибонуклеазой или дезоксирибонуклеазой. В зависимости от фермента остаются неокрашенными места локализации РНК или ДНК. ПРИМЕЧАНИЯ В метиловом зеленом седьмая метильная группа фиксирована слабо. Поэтому данный краситель обычно содерг жит примесь метилового фиолетового. Эту примесь рекомендуется перед использованием удалять экстракцией в хлороформе, лучше всего путем встряхивания в делительной воронке. При оценке содержания РНК в клетке следует обрат щать внимание на то, что пиронин частично экстрагируется из срезов при промьшании и обезвоживании. ВЫЯВЛЕНИЕ ДНК И РНК СМЕСЬЮ ГАЛЛОЦИАНИН-ХРОМОВЫЕ КВАСЦЫ МЕТОДИКА 1. Фиксация маленьких кусочков ткани в жидкости 106 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов Карнуа или в этаноле, 2—4 ч при температуре от +2 до +4° С, заливка в парафин. 2. Срезы депарафинировать и через ряд спиртов убывающей концентрации довести до воды. 3. Поместить при комнатной температуре в раствор галлоциананин — хромовые квасцы на 24—48 ч. Приготовление красителя: 0,15 г галлоцианина кипятить в 10 мл 5%-ных хромовых квасцов; после охлаждения профильтровать и довести дистиллированной водой до 100 мл рН красящего раствора довести до 1,64 (можно 1 н. НС1). 4. Дифференцировка желаемой продолжительности в дистиллированной воде, ряд спиртов возрастающей концентрации, заключение в нейтральный бальзам или цедакс. РЕЗУЛЬТАТ Ядра, цитоплазматические структуры, содержащие РНК, такие, как тельца Ниссля в нервных клетках, окрашиваются в темно-синий или черный цвет. ПРИМЕЧАНИЯ Продолжительность окрашивания можно сократить (правда, при одновременном усилении неспецифического окрашивания) "благодаря повышению температуры (44—56° С) до 4 ч. Галлоцианин—хромовые квасцы можно также использовать для докрашивания ядер при радиоавтографии. МЕТОДЫ ЭКСТРАКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ а) ЭКСТРАКЦИЯ НУКЛЕАЗАМИ МЕТОДИКА 1. Фиксация в жидкости Карнуа, заливка в парафин. 2. Срезы депарафинировать и через ряд спиртов убывающей концентрации довести до дистиллированной воды. 3. Инкубировать при + 37°С в растворе кристаллической рибонуклеазы или дезоксирибонуклеазы в концентра- 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 107 ции от 0,5 до 1 мг в 1 мл дистиллированной воды, 1—3 ч; параллельные срезы инкубируют в аналогичных условиях в дистиллированной воде. 4. Промыть в дистиллированной воде. 5. Окрашивать обработанные ферментом и контрольные срезы основным красителем. РЕЗУЛЬТАТ Базофильный материал, удаляемый рибонуклеазой,— РНК, а удаляемый дезоксирибонуклеазой,—ДНК. ПРИМЕЧАНИЯ Используемая рибонуклеаза должна быть свободна от примесей солей и протеаз; Ценкер-формол в качестве фиксирующего средства непригоден. Дезокснрибонуклеазы при воздействии высокой температуры денатурируются и инактивируются. Для подавления протеолитической активности дезокснрибонуклеазы в инкубационную среду можно добавить 0,05 М цистеин или гидроксил амин. б) ЭКСТРАКЦИЯ соляной кислотой МЕТОДИКА 1. Фиксация в жидкости Карнуа или этанол-уксусной кислоте, заливка в парафин. ' 2. Срезы депарафинировать и через ряд спиртов убывающей концентрации довести до дистиллированной воды. 3. Для удаления РНК срезы обработать 2 н. НС1 при + 3°С, 16 ч, или 1 н. НС1 при + 60°С, 3—10 мин. Для удаления РНК и ДНК поместить срезы в 1 н. НС1 при + 60°С на 20—30 мин. 4. Срезы тщательно промыть и провести реакцию на нуклеиновые кислоты. 108 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов ПРИМЕЧАНИЯ Экстракция соляной кислотой не является специфичной в узком смысле этого слова. Сохранность ткани в этом случае лучше, чем при экстракции хлорной или трихлорук-сусной кислотой. 4.3. УГЛЕВОДЫ Методы гистохимического выявления углеводов относятся, как правило, к методам общего анализа групп. Разработка методов идентификации отдельных углеводов находится лишь в начальной стадии. 4.3.1. КЛАССИФИКАЦИЯ УГЛЕВОДОВ Знание структуры и свойств углеводов является необходимой предпосылкой для развития методов их гистохимического анализа. Часто бывает трудно привести и согласовать результаты гистохимических и биохимических исследований. Углеводы можно разделить на три, основные группы: 1. Моносахариды. 2. Олигосахариды. 3. Полисахариды. Моносахариды, или простые сахара, равно как и олигосахариды (сложные углеводы, молекулы которых состоят из небольшого числа моносахаридных единиц), находятся в организме главным образом в растворенном состоянии, и поэтому выявить их гистохимическими методами очень трудно. Исключение составляют моносахариды, связанные в форме гликолипидов, и нейраминовая кислота. Полисахариды состоят из моносахаридных единиц, связанных в цепочки гликозидными связями. К ним относится гликоген, который в тканях встречается в комплексе с белками и липоидами. В тканях встречаются следующие полисахариды. 1. Запасаемые полисахариды, например гликоген, предшественники гликогена и крахмал. 2. Нейтральные мукополисахариды (нейтральные му-коидные вещества). К нейтральным полисахаридам, связанным с белками, принадлежат, в частности, хитин, слизь желудка свиньи, углеводы, образующие капсулу пневмо- 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 109 кокков, а также некоторые продукты секреции желез эпителиального происхождения. 3. Кислые мукополисахариды (кислые мукоидные вещества). Полисахариды этой группы состоят из гексозамяна и гексуроновой кислоты. Кислый характер этих полисахаридов объясняется, присутствием в них радикалов серной, сиаловой, глюкуроновой, идуроновой кислот или других групп, дающих кислую реакцию. 4. Мукопротеиды представляют собой полисахариды, ковалентно связанные с пептидами и содержащие более 4% гексозамина. Во многих случаях концевой группой является сиаловая кислота. В качестве примера можно назвать муцины подчелюстной железы и слизистой оболочки желудка. 5. Гликопротеиды, например овальбумин, фракции сывороточного альбумина и сывороточного глобулина (иммуноглобулины), коллаген и ретикулин, близки к мукопро-теидам, но содержат менее 4% гексозамина. 6. Гликолипиды содержат жирные кислоты, сфинтозин и углеводы. Они представлены главным образом церебро-зидами и ганглиозидами. В качестве углеводного компонента в них содержатся гексозы (глюкоза или преимущественно галактоза в цереброзидах); нейраминовая кислота представлена сиаловыми кислотами. За исключением запасаемых полисахаридов (гликоген, крахмал), все прочие углево |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 |
Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |