Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

льные условия кислотного или ферментативного гидролиза

Хорошая сохранность структуры и быстрое расщепление ДНКа-зой и РНКазой

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 103

2. Срезы депарафинировать и через ряд спиртов убывающей концентрации довести до воды.

3. Быстро промыть в холодной 1 н. НС1.

4. Срезы поместить при 60° С в 1 н. НС1 на оптимальное время гидролиза.

5. Быстро промыть в 1 н. НС1, а затем в дистиллированной воде.

6. Перенести в реактив Шиффа (стр. 131) на 45 мин.

7. Промыть в 3 сменах свежей 802-воды (5 мл 10% K2S2Os, 5 мл 1 н. НС1, дистиллированная вода до 100 мл), 3x2 мин.

8. Промыть в дистиллированной воде, 2 мин.

9. Возможна докраска 0,5%-ным светлым зеленым, 20 с.

10. Обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Структуры, содержащие ДНК, окрашиваются в красно-лиловый цвет. После обработки дезоксирибонуклеазой реакция отрицательна.

ПРИМЕЧАНИЯ

В замороженных срезах реактив Шиффа окрашивает помимо ДНК и ацетальфосфатиды. Для проведения гидролиза вместо 1 н. НС1 можно использовать следующие реагенты: хлорную кислоту, трихлоруксусную кислоту, фосфорную кислоту, азотную кислоту, серную кислоту, ором.

Интенсивность реакции Фёльгена можно оценивать количественно с помощью цитофотометрических измерений, поскольку при оптимальных сроках гидролиза реакция окрашивания альдегидных групп пропорциональна содержанию ДНК. Сопоставимые результаты можно получать при полном соблюдении постоянных условий опыта, таких, как способ фиксации, продолжительность и температура гидролиза, качество реактива Ши< фа, состав 802-воды.

104 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ДНК С ПОМОЩЬЮ БАО (RUCH, 1970)

МЕТОДИКА

1. Фиксация в этаноле, этанолуксусной кислоте или формальдегиде.

2. Депарафинированные срезы, клетки или изолированные субклеточные частицы поместить в дистиллированную воду на 2 мин.

3. Срезы поместить при +60° С в 1 н. НС1 на оптимальное время гидролиза (8 — 12 мин).

4. Промыть в дистиллированной воде, 5 мин.

5. Окрасить БАО-раствором (100 мл 0,01% БАО-ра-створа, 10 мл 1 н. НС1, 5 мл 10% NaHSOA 2 ч.

6. Промыть в дистиллированной воде, 2 мин.

7. Промыть в растворе сульфита (180 мл дистиллированной воды, 10 мл 1 н. НС1, 10 мл 10% NaHS03), 3 х

х 2 мин.

8. Промыть в проточной воде, 10 мин.

9. Обезводить в 50, 70, 95 и 100%-ном этаноле, по 30 с.

10. Просветлить глицерином или ксилилом, 2 х 30 с.

11. Заключить во флуормаунт. *

12. Исследовать в флуоресцентном микроскопе; фильтр УФ (UG1), пропускающий возбуждающий свет.

РЕЗУЛЬТАТ

Хроматиновые структуры дают яркую синюю флуоресценцию.

ВЫЯВЛЕНИЕ ДНК И РНК МЕТИЛОВЫМ ЗЕЛЕНЫМ -ПИРОНИНОМ (МОДИФИКАЦИЯ KURNICK 1955)

МЕТОДИКА

1. Фиксация 10%-ным забуференным формальдегидом, рН 7,0, 4—12 ч или по Карнуа, 4—24 ч при +4°С; заливка в парафин.

2. Депарафинированные срезы довести до дистиллированной воды.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 105

3. Окрасить срезы в смеси метилового зеленого—ш*-ронина, 6 мин при температуре от +18 до + 24°С. (Смесь метилового зеленого с пиронином: 12,5 мл 2%-ного пи-ронина GS (Chroma), 7,5 мл 2%-ного метилового зеленого (Fluka), 30 мл дистиллированной воды.)

4. Просушить фильтровальной бумагой.

5. Дифференцировать в н-бутаноле, 2x5 мин.

6. Просветлить в ксилоле, 3x5 мин.

7. Заключить в нейтральный бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Структуры, содержащие ДНК, окрашиваются в голубовато-зеленый цвет, а содержащие РНК—в красный.

КОНТРОЛЬ

Предварительная обработка срезов рибонуклеазой или дезоксирибонуклеазой. В зависимости от фермента остаются неокрашенными места локализации РНК или ДНК.

ПРИМЕЧАНИЯ

В метиловом зеленом седьмая метильная группа фиксирована слабо. Поэтому данный краситель обычно содерг жит примесь метилового фиолетового. Эту примесь рекомендуется перед использованием удалять экстракцией в хлороформе, лучше всего путем встряхивания в делительной воронке.

При оценке содержания РНК в клетке следует обрат щать внимание на то, что пиронин частично экстрагируется из срезов при промьшании и обезвоживании.

ВЫЯВЛЕНИЕ ДНК И РНК СМЕСЬЮ ГАЛЛОЦИАНИН-ХРОМОВЫЕ КВАСЦЫ

МЕТОДИКА

1. Фиксация маленьких кусочков ткани в жидкости

106 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

Карнуа или в этаноле, 2—4 ч при температуре от +2 до +4° С, заливка в парафин.

2. Срезы депарафинировать и через ряд спиртов убывающей концентрации довести до воды.

3. Поместить при комнатной температуре в раствор галлоциананин — хромовые квасцы на 24—48 ч.

Приготовление красителя: 0,15 г галлоцианина кипятить в 10 мл 5%-ных хромовых квасцов; после охлаждения профильтровать и довести дистиллированной водой до 100 мл рН красящего раствора довести до 1,64 (можно 1 н. НС1).

4. Дифференцировка желаемой продолжительности в дистиллированной воде, ряд спиртов возрастающей концентрации, заключение в нейтральный бальзам или цедакс.

РЕЗУЛЬТАТ

Ядра, цитоплазматические структуры, содержащие РНК, такие, как тельца Ниссля в нервных клетках, окрашиваются в темно-синий или черный цвет.

ПРИМЕЧАНИЯ

Продолжительность окрашивания можно сократить (правда, при одновременном усилении неспецифического окрашивания) "благодаря повышению температуры (44—56° С) до 4 ч. Галлоцианин—хромовые квасцы можно также использовать для докрашивания ядер при радиоавтографии.

МЕТОДЫ ЭКСТРАКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

а) ЭКСТРАКЦИЯ НУКЛЕАЗАМИ

МЕТОДИКА

1. Фиксация в жидкости Карнуа, заливка в парафин.

2. Срезы депарафинировать и через ряд спиртов убывающей концентрации довести до дистиллированной воды.

3. Инкубировать при + 37°С в растворе кристаллической рибонуклеазы или дезоксирибонуклеазы в концентра-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 107

ции от 0,5 до 1 мг в 1 мл дистиллированной воды, 1—3 ч; параллельные срезы инкубируют в аналогичных условиях в дистиллированной воде.

4. Промыть в дистиллированной воде.

5. Окрашивать обработанные ферментом и контрольные срезы основным красителем.

РЕЗУЛЬТАТ

Базофильный материал, удаляемый рибонуклеазой,— РНК, а удаляемый дезоксирибонуклеазой,—ДНК.

ПРИМЕЧАНИЯ

Используемая рибонуклеаза должна быть свободна от примесей солей и протеаз; Ценкер-формол в качестве фиксирующего средства непригоден. Дезокснрибонуклеазы при воздействии высокой температуры денатурируются и инактивируются. Для подавления протеолитической активности дезокснрибонуклеазы в инкубационную среду можно добавить 0,05 М цистеин или гидроксил амин.

б) ЭКСТРАКЦИЯ соляной кислотой МЕТОДИКА

1. Фиксация в жидкости Карнуа или этанол-уксусной кислоте, заливка в парафин.

' 2. Срезы депарафинировать и через ряд спиртов убывающей концентрации довести до дистиллированной воды.

3. Для удаления РНК срезы обработать 2 н. НС1 при + 3°С, 16 ч, или 1 н. НС1 при + 60°С, 3—10 мин. Для удаления РНК и ДНК поместить срезы в 1 н. НС1 при + 60°С на 20—30 мин.

4. Срезы тщательно промыть и провести реакцию на нуклеиновые кислоты.

108 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ПРИМЕЧАНИЯ

Экстракция соляной кислотой не является специфичной в узком смысле этого слова. Сохранность ткани в этом случае лучше, чем при экстракции хлорной или трихлорук-сусной кислотой.

4.3. УГЛЕВОДЫ

Методы гистохимического выявления углеводов относятся, как правило, к методам общего анализа групп. Разработка методов идентификации отдельных углеводов находится лишь в начальной стадии.

4.3.1. КЛАССИФИКАЦИЯ УГЛЕВОДОВ

Знание структуры и свойств углеводов является необходимой предпосылкой для развития методов их гистохимического анализа. Часто бывает трудно привести и согласовать результаты гистохимических и биохимических исследований.

Углеводы можно разделить на три, основные группы:

1. Моносахариды. 2. Олигосахариды. 3. Полисахариды. Моносахариды, или простые сахара, равно как и олигосахариды (сложные углеводы, молекулы которых состоят из небольшого числа моносахаридных единиц), находятся в организме главным образом в растворенном состоянии, и поэтому выявить их гистохимическими методами очень трудно. Исключение составляют моносахариды, связанные в форме гликолипидов, и нейраминовая кислота.

Полисахариды состоят из моносахаридных единиц, связанных в цепочки гликозидными связями. К ним относится гликоген, который в тканях встречается в комплексе с белками и липоидами.

В тканях встречаются следующие полисахариды.

1. Запасаемые полисахариды, например гликоген, предшественники гликогена и крахмал.

2. Нейтральные мукополисахариды (нейтральные му-коидные вещества). К нейтральным полисахаридам, связанным с белками, принадлежат, в частности, хитин, слизь желудка свиньи, углеводы, образующие капсулу пневмо-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 109

кокков, а также некоторые продукты секреции желез эпителиального происхождения.

3. Кислые мукополисахариды (кислые мукоидные вещества). Полисахариды этой группы состоят из гексозамяна и гексуроновой кислоты. Кислый характер этих полисахаридов объясняется, присутствием в них радикалов серной, сиаловой, глюкуроновой, идуроновой кислот или других групп, дающих кислую реакцию.

4. Мукопротеиды представляют собой полисахариды, ковалентно связанные с пептидами и содержащие более 4% гексозамина. Во многих случаях концевой группой является сиаловая кислота. В качестве примера можно назвать муцины подчелюстной железы и слизистой оболочки желудка.

5. Гликопротеиды, например овальбумин, фракции сывороточного альбумина и сывороточного глобулина (иммуноглобулины), коллаген и ретикулин, близки к мукопро-теидам, но содержат менее 4% гексозамина.

6. Гликолипиды содержат жирные кислоты, сфинтозин и углеводы. Они представлены главным образом церебро-зидами и ганглиозидами. В качестве углеводного компонента в них содержатся гексозы (глюкоза или преимущественно галактоза в цереброзидах); нейраминовая кислота представлена сиаловыми кислотами.

За исключением запасаемых полисахаридов (гликоген, крахмал), все прочие углево

страница 16
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2019)