|
|
Основы гистохимии-ном этаноле и 8 капель 1%-ного раствора гипохлорита натрия; раствор необходимо готовить непосредственно перед употреблением). Реакция окрашивания развивается в реакционной смеси постепенно. ,¦ 6. Реактив слить с предметного стекла, препараты осторожно просушить фильтровальной бумагой н поместить на 3 мин в смесь высушенного пиридина и безводного хлороформа. 7. Препараты заключить под покровное стекло в смесь пиридин — хлороформ или в безводный пиридин. Поскольку сохранность таких срезов непродолжительна, рекомендуется просматривать их сразу. РЕЗУЛЬТАТ - Белки, содержащие аргинин, окрашиваются в различные оттенки оранжевого. ПРИМЕЧАНИЯ Модификации реакции Сакагучи для гистохимического выявления аргинина всегда связаны с определенными недостатками. Их можно суммировать следующим образом: а) малая стабильность окраски, б) для проявления окрашивания требуется гипохлорит, который, однако, мешает реакции образования красителя; в) щелочная реакционная среда разрушающе действует на ткань; г) точная л окал из а- 90 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов ция реакции затруднена возможной диффузией продукта. Среди используемых вместо а-нафтола его производных наиболее интенсивную окраску дает 2,4-ди-хлор-1-нафтол; эта окраска в щелочной среде достаточно стабильна для фотометрических измерений. ДИОКШДИНАФТИЛДИСУЛЬФИД(ДДД)-РЕ АКЦИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С БЕЛКОМ СУЛЬФГИДРИЛ ЬНЫХ ГРУПП ПО БАРНЕТУ И ЗЕЛИГМАНУ (BARRNETT, SELIGMAN, 1952, 1953) МЕТОДИКА 1. Фиксация: смесь трихлоруксусной кислоты с этанолом (1%-ная трихлоруксусная кислота в 80%-ном этаноле), 24 ч, Карнуа, формалин. 2. Быстрая заливка в парафин (вакуумный сушильный шкаф); парафиновые срезы прикрепляют небольшим количеством смеси белок—глицерин на предметное стекло. 3. Срезы депарафинировать и через серию спиртов понижающейся концентрации довести до дистиллированной воды. Варианты: срезы, депарафинированные^в ксилоле, промыть в абсолютном этаноле и покрыть 0,5%-ным целлоидином (0,5 г целлоидина растворить в 100 мл абсолютного этанола и эфира 1:1). Тонкую пленку целлоидина на срезах просушить, уплотнить в 70%-ном этаноле, перенести срезы в дистиллированную воду. 4. Срезы обработать (в кювете) при +50° С ДДД-реа-гентом (50 мг 2,2-диокси-6,6-динафтилдисульфида; 30 мл абсолютного этанола; 70 мл натрий-вероналового буфера, рН 8,5), 1 ч. 5. Кювету со срезами охладить при комнатной температуре, 10 мин. 6. Быстро промыть срезы в дистиллированной воде. 7. Промыть в дважды сменяемой дистиллированной воде, подкисленной до рН 4—4,5 уксусной кислотой, 10 мин. 8. После проведения через ряд спиртов возрастающей концентрации промыть срезы в двух сменах абсолютного эфира. 5 мин. 9. Довести через ряд спиртов до дистиллированной воды и сполоснуть в ней. 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 91 10. Срезы при комнатной температуре поместить в свежеприготовленный 0,1%-ный раствор тетразотированного диортоанизидина (соль прочного синего В) на 0,1 М фосфатном буфере Сёренсена, рН 7,4, 2 мин. 11. Промыть в проточной воде и затем в дистиллированной. 12. Монтировать в глицерин-желатине или провести через серию спиртов возрастающей концентрации и ксилол и заключить в бальзам. РЕЗУЛЬТАТ Структуры с большим количеством активных SH-групп окрашиваются в синий цвет, при меньшем количестве более рассеянных SH-групп возникает красное окрашивание. ПРИМЕЧАНИЯ Для прохождения реакции имеет значение концентрация используемой соли диазония. Более высокие концентрации ведут к получению непостоянных результатов. Вместо прочного синего В можно использовать следующие соли диазония: прочный красный RC, прочный синий RR, прочный черный К. ДДД-реакция допускает проведение микроспектрофотометрической количественной оценки содержания SH-групп в срезах тканей. ДДД-реагент можно также использовать для химического определения SH-групп в белках. МЕТОД ОКИСЛЕНИЯ НАДМУРАВЬИНОЙ КИСЛОТОЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ S-S- И SH- ГРУПП ПО ПИРСУ (PEARSE, 1951) МЕТОДИКА 1. Фиксация: кальций-формол, формалин, Ценкер и др., заливка в парафин. 2. Депарафинированные срезы довести до дистиллированной воды. 3. Обработать раствором надмуравьиной кислоты, 10—30 мин (к 40 мл 98%-ной муравьиной кислоты доба- 92 4, Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов вить 4 мл 30%-ной свежей перекиси водорода (Н202) и 0,5 мл концентрированной H2S04; смесь готовить за час до использования и применять не более 24 ч). 4. Срезы промыть в дистиллированной воде, 2—5 мин. 5. Поместить в реактив Шиффа, 30—60 мин. (Особенно пригодны реактивы Шиффа, приготовленные по De Toma-si, Itikawa.) 6. Промыть в проточной слегка теплой воде, 10 мин. 7. Обезводить в ряду спиртов возрастающей концентрации, ксилол, бальзам. РЕЗУЛЬТАТ Структуры, содержащие цистин, в зависимости от его количества окрашиваются в цвета от розового до темно-красного. Особенно интенсивно окрашивается кератинсо-держащие структуры. Четкую реакцию дают нейромедиа-торы, содержащие S —S-группы, а также базофильные клетки передней доли гипофиза. 4.2. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ Нуклеиновые кислоты представляют собой полинуклеотида, образованные из многочисленных мононуклео-тидов. Каждый мононуклеотид состоит из пентозы (дез-оксирибозы или рибозы), ортофосфорной кислоты и пуринового или пиримидинового основания. Пентоза связана дизфирной связью с фосфорной кислотой и гликозидной связью—с основанием. Нуклеиновые кислоты объединяются с основными белками (гистонами) в нуклеопро-теиды. В животных и растительных тканях встречаются два типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК, пентоза представлена дезоксирибозой) и рибонуклеиновая кислота (РНК, пентоза представлена рибозой). ДНК содержит пуриновые основания—аденин и гуанин—и пиримидиновые основания—тимин и цито-зин. В РНК тимин замещен урацил ом. Согласно модели Уотсона—Крика, молекула ДНК состоит из двух нера-зветвленных полинуклеотидных цепей, закрученных в одну двойную спираль вокруг общей оси, Пуриновое основание одной цепи связано водородным мостиком с пиримиди- 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 93 новым основанием другой. При этом возникают две возможности спаривания оснований—аденина с тимином и гуанина с цитозином. Подобное строение молекулы ДНК играет роль как в объяснении генетической репликации молекулы ДНК, так и в гистохимическом ее выявлении. Согласно современным представлениям, РНК в отличие от ДНК всегда существует в виде одиночной цепи. Как правило, ДНК находится в клеточном ядре—в хромосомах и в меньшей мере в митохондриях и пластидах. РНК же встречается в цитоплазме, в ядрышках, в хромосомах и в митохондриях. В цитоплазме РНК находится главным образом в микросомной фракции (гранулы Пала-да, связанные, с эндоплазматическим ретшсулумом). При гистохимическом выявлении нуклеиновых кислот используются следующие принципы (табл. 21): 1. Выявление пуриновых и пиримидиновых оснований по УФ-поглощению. 2. Выявление углеводного компонента. 3. Выявление фосфорной кислоты. 4. Выявление базофилии. 5. Выявление с помощью методов специфической ферментативной и химической экстракции. 4.2.Г. ВЫЯВЛЕНИЕ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ ПО УФ-ПОГЛОЩЕНИЮ Разработанные Касперссоном методы поглощения ультрафиолетовых лучей для количественного и качественного выявления ДНК и РНК основаны на свойстве гетероциклических колец пуриновых и пиримидиновых оснований поглощать ультрафиолетовый свет при длине волны 260 нм. Этот трудоемкий и технически сложный метод дал сильный толчок исследованиям нуклеиновых кислот. Правда, с его помощью нельзя проводить прямое дифференциальное выявление ДНК и РНК. Гистохимические методы выявления нуклеиновых кислот Таблица 21 Результат реакции окрашивания ДНК РНК + + + + (Черное) — Голубовато-пурпурное + Красно-оранжевое + + + + Зеленое Красное + + (10%-ная хлорная кислота, 18 ч, при +4° С + - — Основа Метод Примечания Пуриновые и пиримидиновые основания Пентоза Фосфорная кислота Ферментативная и химическая экстракция УФ-поглощенне при 2600 А Реакция Фёльгена Реакция Фёльгена - серебро-метенамин (Korson, 1964) Метод Турчини (Bladder, Alexander, 1952) Флуорохромирование с помощью бис(4-аминофе-нил)-1,3,4-оксадиазола -БАО (Ruch, 1970) Определение базофилии Окрашивание галлоциани-ном и хромовыми квасцами (de Boer, Sarnaker, 1956) Метиленовый зеленый-пи-ронин (Kurnick, 1955) Рибонуклеаза Дезоксирибонуклеаза Экстракция хлорной кислотой Экстракция трихлоруксусной кислотой Экстоакиия соляной кисло- Доступно количественной оценке То же Надежные методы с достаточной специфичностью 10%-ная хлорная кислота за 20-30 мин при +70° С экстрагирует все нуклеиновые кислоты 5-10%-ная трихлоруксус-ная кислота удаляет при +90° С за 10 мин все нуклеиновые кислоты 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 95 4.2.2. РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ УГЛЕВОДНОГО КОМПОНЕНТА 1. РЕАКЦИЯ ФЁЛЬГЕНА Этот классический метод выявления ДНК основан на том, что в результате мягкого гидролиза под влиянием 1 н. НС1 в фиксированных препаратах происходит отщепление пуриновых оснований, связанных с Q-атомом дезоксирибозы. Ci-C4-C9-Ci-Ci-lly °\ НО-Р=0 Св-с*-с3-с2-с,-пи о НОНР^О С5-С4- Сз-С2-С,-Пу +1,0н.НС1; + 60вС Ce-CrCj-Ci-C,^ о НО-Р=0 \ Св-С^-Сз-Сг-^-Пи о НО-Р=0 ce-c4-Cj-c2-qf Образующиеся при этом реакционноспособные альдегидные группы дают с реактивом Шиффа кислотостойкий краситель — от красного до красно-фиолетового цвета. Для гистохимического выявления ДНК имеет значение тот факт, что при точном соблюдении условий гидролиза фосфатные мостики дезоксирибозы не 96... 4t Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов разрушаются; все соединение не теряет кислотного характера и сохраняет нерастворимость. Образования альдегидов из рибозы РНК в результате кислотного гидролиза не происходит, поскольку при этой процедуре РНК практически полностью вымывается из среза. Поэтому при |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 |
Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |