|
|
Основы гистохимииеина выше 4%. Хорошим примером ^такого окрашивания является избирательное выявление нейромедиаторов, Сульфогруппы, образующиеся в результате окисления кислым раствором КМп04, можно выявлять с помощью псевдоизоцианина в монохроматическом свете в обычном или флуоресцентном микроскопе. 4.1.3. БЛОКИРОВАНИЕ И ПРЕВРАЩЕНИЕ РЕАК-ЦИОННОСПОСОБНЫХ ГРУПП В БЕЛКАХ Методы блокирования незаменимы в качестве контроля при гистохимических реакциях. Блокирование осуществляется путем разрушения определенных химических групп, путем обратимого блокирования или в результате связывания с образованием окрашенных комплексов или комплексов, приобретающих окраску после соответствующей дополнительной обработки. Эти методы могут одновременно служить реакциями выявления определенных реакционноспособных групп (например, окислительное де- 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 83 Таблица 19 Методы Блокированные группы или аминокислоты Дезаминирование — NH2 Динитрофенилирование NH2-, фенольные, имидазольные, SH- группы Ацилирование NH2-, окси-, феиольные и SH-группы Нитробензоилирование NH2-, тирозил-ОН Метилирование а) в мягких условиях соон- б) в жестких условиях СООН-, NH2- Деметилирование Этерифицированные кислые группы вновь высвобождаются Окисление надмуравьиной Триптофан, цистин кислотой Окисление надуксусной То же кислотой Окисление персульфатом Триптофан Иодирование Тирозин (триптофан) Окисление иодом -SH Карбоксиалкилирование -SH Блокирование малеинимидом -SH Блокирование меркаптидом -SH а) хлоридом ртути б) хлоридом фенил ртути -SH Восстановление тиогликолатом -S-S- заминирование, реакция с динитрофторбензолом). В табл. 19 перечислены обычно используемые реакции подобного, рода. 4.1.4. ЭЛЕКТЮННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ БЕЛКОВ Принципы используемых в световой микроскопии методов, основанных на выявлении реакционноспособных групп белков, применимы и в электронной микроскопии. Но их основной недостаток состоит в слабом для электронной микроскопии контрастировании. В табл. 20 представлены электронно-микроскопические методы выявления белков, позволяющие получать доступные интерпретации результаты. 84 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов Таблица 20 Группе Метод Авторы -NH2 -S-S- Основные аминокислоты Преимущественно имидозольные и фенильные группы Реакция нингидрин-Т-протеинат серебра Реакция метенамин — серебро — тиосульфат Контрастирование фос-форновольфрамовой кислотой Реакция сочетания с диазонием Flynn (1970) Swift (1969) Silverman, Glick (1969a, b) Tice, Barrnett (1965) 4.1.5. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКОВ РЕАКЦИЯ С ДИНИТРОФТОРБЕНЗОЛОМ (ДНФБ-РЕАКЦИЯ) ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОБЩЕГО БЕЛКА—МОДИФИКАЦИЯ БЕРСТОНА (BURSTONE) МЕТОДИКА 1. Фиксация в этаноле, ацетоне, формальдегиде; заливка в парафин. 2. Промыть депарафинированные срезы в этаноле. 3. Обработать в 1%-ном растворе ДНФБ в 90%-но*! этаноле, содержащем 0,01 н. (0,04%) NaOH, 20—24 ч при комнатной температуре. 4. Промыть в четырех сменах 90%-ного этанола*. 5. Промыть в дистиллированной воде. 6. Восстановить 5%-ным дитионитом натри* (Na2S204), 40 мин, 45 — 60° С (при этой процедуре желтая окраска обесцвечивается; при комнатной температуре про* должительность восстановления нитрогрупп больше), j 7. Для диазотирования поместить срезы на 5 мин пр|н температуре от 0 до —4° С в следующий раствор: 3 м|| 10%-ной серной кислоты (H2S04) довести до 50 мя 5%-ным нитритом натрия (раствор NaNOz и серную киср лоту перед сливанием следует охладить до 4° С). 8. Промыть в дистиллированной воде. 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 83 9. Обработать холодным (4° С) веронал-ацетатным буфером (рН 9,2), насыщенным Н-кислотой или р-нафто-лом, 15 мин. 10. Промыть в дистиллированной воде и в 70%-ном этаноле, содержащем 1% НС1. 11. Обезводить, просветлить в ксилоле и заключить в синтетическую среду. РЕЗУЛЬТАТ Положительная реакция выражается в образовании комплекса азокрасителя красновато-оранжевого цвета. Поскольку выявляемые группы встречаются повсюду, окрашивание наблюдается во всем срезе. Интенсивно окрашиваются эластические волокна, коллагеновые волокна и эритроциты. НИНГИДРИН-ШИФФ (АЛЛОКСАН-ШИФФ)-РЕАКЦИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ !ЧН2-ГРУПП МЕТОДИКА 1. Фиксация в жидкостях Карнуа, Ценкера, этаноле с 5%-ной уксусной кислотой, заливка в парафин. 2. Депарафинировать срезы и промыть в двух сменах абсолютного этанола. 3. Обработать срезы 0,5%-ным нингидрином или 1%-ным раствором аллоксана в абсолютном этаноле (16^20 ч при 37°С). 4. Промыть проточной водой, 2—5 мин. 5. Поместить срезы в реактив Шиффа, 30 мин при комнатной температуре. 6. Промыть в 3-—4 сменах SOj-воды (200 мл дистиллированной воды +10 мл 10%-ного бисульфита натрия +10 мл 1 н. НС1), 2 мин. 7. Промыть проточной водой, 10 мин. 8. Обезводить в спиртах, ксилол, бальзам. РЕЗУЛЬТАТ NHj-группы, связанные с белком, приобретают окраску от красной до красно-фиолетовой. 86 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов ПРИМЕЧАНИЯ Пункт 6 можно опустить. После пункта 7 можно провести окрашивание ядер, например гемалауном. Поскольку NH2-rpynnbi, связанные с белком, имеют повсеместное распределение, реакцию с нингидрином или реакцию ал-локсан-Шифф можно использовать также для ориентировочного изучения распределения белков. СМЕШАННЫЙ МЕТОД С АНГИДРИДОМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БОКОВЫХ КАРБОКСИЛЬНЫ.- ГРУПП ПО БАРНЕТУ И ЗЕЛИГМА-. НУ (BARRNETT, SELIGMAN) МЕТОДИКА 1. Фиксация: 10%-ный формальдегид, 80%-ный этанол; заливка в парафин. 2. Депарафинировать срезы в петролейном эфире, быстро просушить и промыть в ледяной уксусной кислоте;? 2 мин. 3. Инкубация в смеси из равных частей уксусного ангидрида и безводного пиридина, 1 ч при 60°'С. 4. Промыть в ледяной уксусной кислоте и абсолютном этаноле. 5. Инкубировать срезы в 0,1%-ном гидразиде 2-ок-; си-3-нафтойной кислоты (50 мг гидразида растворить в 2,5 мл теплой уксусной кислоты и добавить 47,5 мл 50%! этанола), 2 ч при 22° С. ' 6. Промыть в трех сменах 50%-ного этанола по 10 мин. 7. Инкубировать в 0,5 н. НС1, 10 мин при 22° С. 8. Промыть в дистиллированной воде и затем в трех сменах 1%-ного бикарбоната натрия. 9. Промыть многократно в нескольких сменах дистиллированной воды. 10. Перенести срезы в раствор из равных частей 0,06 М фосфатного буфера Сёренсена (рН 7,6) и абсолютного эта-: нола, к которому добавлен прочный синий В (1 мг/мл). Реакция окрашивания развивается за 2—5 мин. 11. Промыть в дистиллированной воде. 12. Обезводить в спиртах; ксилол, бальзам. 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 87 РЕЗУЛЬТАТ Карбоксильные группы в боковых цепях, связанные с белком, обусловливают пурпурно-красное окрашивание. РЕАКЦИЯ МИЛЛОНА ПО БЕЙКЕРУ (BAKER, 1956) МЕТОДИКА 1. Фиксация: формальдегид; заливка в парафин или целлоидин. 2. Депарафинировать и провести через 50%-ный этанол до дистиллированной воды. Целлоидиновые срезы толщиной от 20 до 30 мкм провести через 50%-ный этанол до дистиллированной воды. 3. Поместить срезы в стеклянный сосуд, наполненный реактивом Миллона, и нагреть до кипения (реактив М ил-лона : к 100 мл 10%-ной H2S04 добавляют 10 г сульфата ртути и при нагревании растворяют; раствор охлаждают и доводят дистиллированной водой до 200 мл; к 5 мл этого раствора перед употреблением добавляют 0,5 мл 0,25% нитрита натрия. 4. Охладить до комнатной температуры в течение нескольких минут. 5. Промыть срезы в трех сменах дистиллированной воды, по 2 мин. 6. Заключить в глицерин-желатину, обезводить в этаноле и заключить в бальзам через ксилол. РЕЗУЛЬТАТ Положительная реакция проявляется красным или желтовато-красным окрашиванием. Интенсивность окрашивания зависит от количества тирозина в структурах, содержащих белки. РЕАКЦИЯ ДИМЕТИЛАМИНОБЕНЗАЛЬДЕГИД- НИТРИТ ПО АДАМСУ (ADAMS, 1957) МЕТОДИКА 1. Фиксация: 4—10%-ный нейтральный формалин, 88 4, Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 4—12 ч; 80%-ный этанол с 1%-ной трихлоруксусной кислотой, 24 ч; заливка в парафин. 2. Депарафинирование срезов в ксилоле, помещение в абсолютный этанол, просушивание при комнатной температуре (30—50 с). 3. Обработать 50%-ным и-диметиламинобензальдеги-дом в концентрированной НС1, 1 мин. 4. Поместить срезы в 1%-ный нитрит натрия в концен- Промыть срезы в проточной воде, 30 с. 6, Быстро промыть в 1%-ном НСЬэтаноле. 7, Обезводить в спиртах возрастающей концентрации, ксилол, бальзам. РЕЗУЛЬТАТ Белки, содержащие триптофан, окрашиваются в темно-синий цвет различной интенсивности. Сильное окрашивание дают: гранулы клеток Панета, гранулы пепсиногена в главных клетках, зимогенные гранулы экзокринных клеток поджелудочной железы (хороший тест-объект!), мышцы, фибрин, фибриноид, нейрокератин, чехлы волосяных луковиц. ПРИМЕЧАНИЯ В п. 2 срезы вместо высушивания можно после удаления этанола покрывать тонкой пленкой целлоидина (0,25%-ный раствор целлоидина в смеси этанол-эфир 1:1). Для приклеивания среза более пригодна хромат — желатина, чем белок-глицерин. РЕАКЦИЯ САКАГУЧИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АРГИНИНА; МОДИФИКАЦИЯ БЕЙКЕРА (BAKER, 1947) МЕТОДИКА 1. Фиксация: Ценкер, Буэн, Карнуа, Суза, сулема-формалин по Гейденгайну (допустим также нейтральный формалин); заливка в парафин. мин. 4. Гистохимия Отдельных классов веществ и ферментов 89 2. Парафиновые срезы, приклеенные к предметному стеклу смесью белок—глицерин, депарафинировать в ксилоле или толуоле и после обработки абсолютным спиртом покрыть тонкой пленкой целлоидина (1%-ный раствор целлоидина в смеси этанол — эфир 1:1) и уплотнить в 70%-ном этаноле. 3. Через 50%-ный этанол довести срезы до дистиллированной воды и тщательно промыть. 4. Вынуть срезы из воды и высушить движениями на воздухе. 5. Обработать раствором ос-нафтол — гипохлорит натрия 15 мин (приготовление раствора а-нафтол — гипохлорит натрия: к 4 мл 1% NaOH добавить 4 капли 1%-ного раствора а-нафтола в 70% |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 |
Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |