Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

еина выше 4%. Хорошим примером ^такого окрашивания является избирательное выявление нейромедиаторов,

Сульфогруппы, образующиеся в результате окисления кислым раствором КМп04, можно выявлять с помощью псевдоизоцианина в монохроматическом свете в обычном или флуоресцентном микроскопе.

4.1.3. БЛОКИРОВАНИЕ И ПРЕВРАЩЕНИЕ РЕАК-ЦИОННОСПОСОБНЫХ ГРУПП В БЕЛКАХ

Методы блокирования незаменимы в качестве контроля при гистохимических реакциях. Блокирование осуществляется путем разрушения определенных химических групп, путем обратимого блокирования или в результате связывания с образованием окрашенных комплексов или комплексов, приобретающих окраску после соответствующей дополнительной обработки. Эти методы могут одновременно служить реакциями выявления определенных реакционноспособных групп (например, окислительное де-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 83

Таблица 19

Методы Блокированные группы или аминокислоты

Дезаминирование — NH2

Динитрофенилирование NH2-, фенольные, имидазольные, SH-

группы

Ацилирование NH2-, окси-, феиольные и SH-группы

Нитробензоилирование NH2-, тирозил-ОН

Метилирование

а) в мягких условиях соон-

б) в жестких условиях СООН-, NH2-

Деметилирование Этерифицированные кислые группы

вновь высвобождаются

Окисление надмуравьиной Триптофан, цистин

кислотой

Окисление надуксусной То же

кислотой

Окисление персульфатом Триптофан

Иодирование Тирозин (триптофан)

Окисление иодом -SH

Карбоксиалкилирование -SH

Блокирование малеинимидом -SH

Блокирование меркаптидом -SH

а) хлоридом ртути

б) хлоридом фенил ртути -SH

Восстановление тиогликолатом -S-S-

заминирование, реакция с динитрофторбензолом). В табл. 19 перечислены обычно используемые реакции подобного, рода.

4.1.4. ЭЛЕКТЮННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Принципы используемых в световой микроскопии методов, основанных на выявлении реакционноспособных групп белков, применимы и в электронной микроскопии. Но их основной недостаток состоит в слабом для электронной микроскопии контрастировании.

В табл. 20 представлены электронно-микроскопические методы выявления белков, позволяющие получать доступные интерпретации результаты.

84 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

Таблица 20

Группе Метод Авторы

-NH2 -S-S- Основные аминокислоты Преимущественно имидозольные и фенильные группы Реакция нингидрин-Т-протеинат серебра Реакция метенамин — серебро — тиосульфат Контрастирование фос-форновольфрамовой кислотой Реакция сочетания с диазонием Flynn (1970) Swift (1969) Silverman, Glick (1969a, b) Tice, Barrnett (1965)

4.1.5. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКОВ

РЕАКЦИЯ С ДИНИТРОФТОРБЕНЗОЛОМ (ДНФБ-РЕАКЦИЯ) ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОБЩЕГО БЕЛКА—МОДИФИКАЦИЯ БЕРСТОНА (BURSTONE)

МЕТОДИКА

1. Фиксация в этаноле, ацетоне, формальдегиде; заливка в парафин.

2. Промыть депарафинированные срезы в этаноле.

3. Обработать в 1%-ном растворе ДНФБ в 90%-но*! этаноле, содержащем 0,01 н. (0,04%) NaOH, 20—24 ч при комнатной температуре.

4. Промыть в четырех сменах 90%-ного этанола*.

5. Промыть в дистиллированной воде.

6. Восстановить 5%-ным дитионитом натри* (Na2S204), 40 мин, 45 — 60° С (при этой процедуре желтая окраска обесцвечивается; при комнатной температуре про* должительность восстановления нитрогрупп больше), j

7. Для диазотирования поместить срезы на 5 мин пр|н температуре от 0 до —4° С в следующий раствор: 3 м|| 10%-ной серной кислоты (H2S04) довести до 50 мя 5%-ным нитритом натрия (раствор NaNOz и серную киср лоту перед сливанием следует охладить до 4° С).

8. Промыть в дистиллированной воде.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 83

9. Обработать холодным (4° С) веронал-ацетатным буфером (рН 9,2), насыщенным Н-кислотой или р-нафто-лом, 15 мин.

10. Промыть в дистиллированной воде и в 70%-ном этаноле, содержащем 1% НС1.

11. Обезводить, просветлить в ксилоле и заключить в синтетическую среду.

РЕЗУЛЬТАТ

Положительная реакция выражается в образовании комплекса азокрасителя красновато-оранжевого цвета. Поскольку выявляемые группы встречаются повсюду, окрашивание наблюдается во всем срезе. Интенсивно окрашиваются эластические волокна, коллагеновые волокна и эритроциты.

НИНГИДРИН-ШИФФ (АЛЛОКСАН-ШИФФ)-РЕАКЦИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ !ЧН2-ГРУПП

МЕТОДИКА

1. Фиксация в жидкостях Карнуа, Ценкера, этаноле с 5%-ной уксусной кислотой, заливка в парафин.

2. Депарафинировать срезы и промыть в двух сменах абсолютного этанола.

3. Обработать срезы 0,5%-ным нингидрином или 1%-ным раствором аллоксана в абсолютном этаноле (16^20 ч при 37°С).

4. Промыть проточной водой, 2—5 мин.

5. Поместить срезы в реактив Шиффа, 30 мин при комнатной температуре.

6. Промыть в 3-—4 сменах SOj-воды (200 мл дистиллированной воды +10 мл 10%-ного бисульфита натрия +10 мл 1 н. НС1), 2 мин.

7. Промыть проточной водой, 10 мин.

8. Обезводить в спиртах, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

NHj-группы, связанные с белком, приобретают окраску от красной до красно-фиолетовой.

86 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ПРИМЕЧАНИЯ

Пункт 6 можно опустить. После пункта 7 можно провести окрашивание ядер, например гемалауном. Поскольку NH2-rpynnbi, связанные с белком, имеют повсеместное распределение, реакцию с нингидрином или реакцию ал-локсан-Шифф можно использовать также для ориентировочного изучения распределения белков.

СМЕШАННЫЙ МЕТОД С АНГИДРИДОМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БОКОВЫХ КАРБОКСИЛЬНЫ.- ГРУПП ПО БАРНЕТУ И ЗЕЛИГМА-. НУ (BARRNETT, SELIGMAN)

МЕТОДИКА

1. Фиксация: 10%-ный формальдегид, 80%-ный этанол; заливка в парафин.

2. Депарафинировать срезы в петролейном эфире, быстро просушить и промыть в ледяной уксусной кислоте;? 2 мин.

3. Инкубация в смеси из равных частей уксусного ангидрида и безводного пиридина, 1 ч при 60°'С.

4. Промыть в ледяной уксусной кислоте и абсолютном этаноле.

5. Инкубировать срезы в 0,1%-ном гидразиде 2-ок-; си-3-нафтойной кислоты (50 мг гидразида растворить в 2,5 мл теплой уксусной кислоты и добавить 47,5 мл 50%! этанола), 2 ч при 22° С. '

6. Промыть в трех сменах 50%-ного этанола по 10 мин.

7. Инкубировать в 0,5 н. НС1, 10 мин при 22° С.

8. Промыть в дистиллированной воде и затем в трех сменах 1%-ного бикарбоната натрия.

9. Промыть многократно в нескольких сменах дистиллированной воды.

10. Перенести срезы в раствор из равных частей 0,06 М фосфатного буфера Сёренсена (рН 7,6) и абсолютного эта-: нола, к которому добавлен прочный синий В (1 мг/мл). Реакция окрашивания развивается за 2—5 мин.

11. Промыть в дистиллированной воде.

12. Обезводить в спиртах; ксилол, бальзам.

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 87

РЕЗУЛЬТАТ

Карбоксильные группы в боковых цепях, связанные с белком, обусловливают пурпурно-красное окрашивание.

РЕАКЦИЯ МИЛЛОНА ПО БЕЙКЕРУ (BAKER, 1956)

МЕТОДИКА

1. Фиксация: формальдегид; заливка в парафин или целлоидин.

2. Депарафинировать и провести через 50%-ный этанол до дистиллированной воды. Целлоидиновые срезы толщиной от 20 до 30 мкм провести через 50%-ный этанол до дистиллированной воды.

3. Поместить срезы в стеклянный сосуд, наполненный реактивом Миллона, и нагреть до кипения (реактив М ил-лона : к 100 мл 10%-ной H2S04 добавляют 10 г сульфата ртути и при нагревании растворяют; раствор охлаждают и доводят дистиллированной водой до 200 мл; к 5 мл этого раствора перед употреблением добавляют 0,5 мл 0,25% нитрита натрия.

4. Охладить до комнатной температуры в течение нескольких минут.

5. Промыть срезы в трех сменах дистиллированной воды, по 2 мин.

6. Заключить в глицерин-желатину, обезводить в этаноле и заключить в бальзам через ксилол.

РЕЗУЛЬТАТ

Положительная реакция проявляется красным или желтовато-красным окрашиванием. Интенсивность окрашивания зависит от количества тирозина в структурах, содержащих белки.

РЕАКЦИЯ ДИМЕТИЛАМИНОБЕНЗАЛЬДЕГИД- НИТРИТ ПО АДАМСУ (ADAMS, 1957)

МЕТОДИКА

1. Фиксация: 4—10%-ный нейтральный формалин,

88 4, Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

4—12 ч; 80%-ный этанол с 1%-ной трихлоруксусной кислотой, 24 ч; заливка в парафин.

2. Депарафинирование срезов в ксилоле, помещение в абсолютный этанол, просушивание при комнатной температуре (30—50 с).

3. Обработать 50%-ным и-диметиламинобензальдеги-дом в концентрированной НС1, 1 мин.

4. Поместить срезы в 1%-ный нитрит натрия в концен-

Промыть срезы в проточной воде, 30 с.

6, Быстро промыть в 1%-ном НСЬэтаноле.

7, Обезводить в спиртах возрастающей концентрации, ксилол, бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ

Белки, содержащие триптофан, окрашиваются в темно-синий цвет различной интенсивности. Сильное окрашивание дают: гранулы клеток Панета, гранулы пепсиногена в главных клетках, зимогенные гранулы экзокринных клеток поджелудочной железы (хороший тест-объект!), мышцы, фибрин, фибриноид, нейрокератин, чехлы волосяных луковиц.

ПРИМЕЧАНИЯ

В п. 2 срезы вместо высушивания можно после удаления этанола покрывать тонкой пленкой целлоидина (0,25%-ный раствор целлоидина в смеси этанол-эфир 1:1).

Для приклеивания среза более пригодна хромат — желатина, чем белок-глицерин.

РЕАКЦИЯ САКАГУЧИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АРГИНИНА; МОДИФИКАЦИЯ БЕЙКЕРА (BAKER, 1947)

МЕТОДИКА

1. Фиксация: Ценкер, Буэн, Карнуа, Суза, сулема-формалин по Гейденгайну (допустим также нейтральный формалин); заливка в парафин.

мин.

4. Гистохимия Отдельных классов веществ и ферментов 89

2. Парафиновые срезы, приклеенные к предметному стеклу смесью белок—глицерин, депарафинировать в ксилоле или толуоле и после обработки абсолютным спиртом покрыть тонкой пленкой целлоидина (1%-ный раствор целлоидина в смеси этанол — эфир 1:1) и уплотнить в 70%-ном этаноле.

3. Через 50%-ный этанол довести срезы до дистиллированной воды и тщательно промыть.

4. Вынуть срезы из воды и высушить движениями на воздухе.

5. Обработать раствором ос-нафтол — гипохлорит натрия 15 мин (приготовление раствора а-нафтол — гипохлорит натрия: к 4 мл 1% NaOH добавить 4 капли 1%-ного раствора а-нафтола в 70%

страница 13
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.06.2019)