Биологический каталог




Основы гистохимии

Автор Х.Луппа

а по этому методу выявляются триптамин, серотонин и скатол. Методы, в основе которых лежит конденсация с л-диметиламинобензальде-гидом (ДМАБ-реагент Эрлиха), отличаются образованием интенсивно окрашенного продукта реакции и высокой специфичностью.

1. Реакция диметиламинобензальдегиднитрят по Адамсу (ADAMS, 1967)

В этой реакции л-диметиламинобензальдегид конденсируется с триптофаном в присутствии окисляющего агента (у Адамса—нитрит натрия) с образованием темно-голубого пигмента. С помощью обработки концентрирован-

74 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов_

ной соляной кислотой Адамсу удалось получить интенсивное окрашивание.

н

{^f* \^ Альдегид Триптосрап NHz

*СН2-СН-СООН

Н R

Окисление _ г , ^СНСООН -:—*¦ Голубой пигмент

Hz

Производное fi ~ карболина

2. Розиндольная реакция по Гленнеру (Glenner, 1957)

Этот метод представляет собой вариант метода конденсации с л-диметиламинобензальдйгидом. При этом в присутствии хлорной кислоты происходит бензилидено-вая конденсация триптофана с диметиламинобензальдегидом; образуется фенилиндолилметановый компонент, находящийся в равновесии со своей лейкоформой. Окисление лейкоформы при помощи азотной кислоты ведет к образованию фенилиндолилиндолиденметана или так называемого розиндольного красителя, который может существовать в трех резонансных формах.

N(CH3)2

Окисление

N(CH3)2

Леикокомпонент

Розиндол аренилиндолилиндодшшден-метан)

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 75

3. Бензилиденовая реакция по Гленнеру и Лилли (Glenner, Lillie, 1957)

В реакции сочетания с и-диметиламинобензилиденом исследуемые срезы обрабатываются и-ДМАБ в уксусной кислоте, вслед за чем происходит реакция сочетания со свежеприготовленной диазотированной 8-амино-1-нафтол-5-сульфоновой кислотой. Индольные производные в этом методе в зависимости от их концентрации окрашиваются в различные тона голубого—от светлого до темного.

HOSOi

Триптофанбенэшшдии

Триптодшнбенэилидин -в- аз о - / - нафтол -5- сулыроновая кислота

4. Ксанп ид рольная реакция по Лилли (Lillie, 1957)

Гистохимическое выявление в своей основе имеет реакцию определения триптофана по Дикману и Кроцетту (Dickman, Crocett, 1957). По сравнению с биохимическим методом было изменено соотношение соляной и уксусной кислот в сторону снижения. Продукт конденсации ксантги-дрола с триптофаном (триптамином, индолом, скатолом, пирролом) фиолетового цвета, нестабилен. Эта реакция

76 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов_

специфична и более чувствительна, чем реакция с и-диме-тиламинобензальдегидом.

Ксантгибрал Ксангпгидрилтриптоашн

е) ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ АРГИНИНА

Легкорастворимая в воде, дающая щелочную реакцию аминокислота аргинин является составной частью многих основных белков. Гистохимическое выявление аргинина, таким образом, имеет важное диагностическое значение для выявления основных белков в ткани.

Гистохимическая реакция окрашивания для выявления гуанидильных групп основана на методе выявления аргинина, предложенном Сакагучи (Sacaguchi). Положительная реакция указывает исключительно на присутствие веществ со следующей общей химической структурой:

^Н-ес

c=N-fl _ \ /т

NH-Cr6*

Среди гистохимических методов выявления аргинина своей простотой и надежностью выделяется модификация Бейкера. Стабильность реакции окрашивания удается по-

4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 7.7

высить, если вместо а-нафтола использовать 2,4-дихлор-1-нафтол. В основе этого метода лежит реакция Сакагучи, в соответствии с которой белки, содержащие аргинин, под воздействием а-нафтола и гипохлорита или гипобромита натрия приобретают красную или оранжево-красную окраску. С 2,4-дихлор-1-нафтолом вместо а-нафтола в щелочной среде развивается окрашивание, интенсивность которого позволяет проводить фотометрические измерения.

ж) РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С БЕЛКАМИ СУЛЬФГИД-РИЛЬНЫХ И ДИСУЛЬФИДНЫХ ГРУПП

Гистохимическое выявление сульфгидрильных (SH —) и дисульфидных групп (— S — S —) основано на наличии в белковых молекулах цистеина или цистина. Поскольку почти все гистохимические реакции направлены лишь на SH-группы, перед проведением основной реакции SS-группы следует восстановить до SH-групп, применив для этого какой-нибудь восстанавливающий агент. Свободные серусодержащие аминокислоты и глутатион не выявляются гистохимически, поскольку они присутствуют в тканях в Очень незначительной концентрации, а также потому, что они вымываются в процессе предварительной обработки ткани.

Наиболее часто используемые методы выявления SH-или S — S-групп перечислены в табл. 18. Ниже описываются три стандартных метода.

1. Метод с ртутным оранжевым по Бенету (Bennett, 1951)

Механизм реакции при этом методе основан на способности SH-групп реагировать с алкильными или арильны-ми ртутными соединениями, образуя меркаптиды. Синтезированный Бенетом для гистохимических целей ртутный оранжевый [1-(4-хлорртутьфенилазо)-2-нафтол] первоначально был назван красным сульфгидрильным реагентом. Этот реагент является азокрасителем, который благодаря содержащейся в нем фенилртутной группе образует с SH-группами окрашенный меркаптид.

Таблица 18

Сравнение гистохимических методов выявления SH- и S - S-групп

Реакция Группа Авторы Чувствительность Реакция блокирования Примечания

Реакция с азидом иода Реакция с нитропрус-сидом Реакция с феррициа-нидом Метод с ртутным оранжевым -SH -SH -SH -SH Ratzenhofer Hammet, Chapman (1938,1939) V Chevremont, Frederic (1943); Adams (1956) - Bennett (1951) Сравнительно высокая Очень низкая Низкая Хлорпикрин, мо-ноиодуксусная кислота, сулема Насыщенный раствор фенил-мерк)фихлори-да в этаноле или бутаноле Клеточная локализация невозможна Специфична; продукт реакции легко диффундирует; требуются толстые срезы Неспецифична для SH-rpynn, поэтому необходимы контрольные реакции Пригодна для цито-фотометрических количественных исследований; реактивы труднодоступны

Продолжение табл. 18.

Реакция

Группа

Авторы

Чувствительность

Реакция блокирования

Примечания

ДДД-реакция

Реакция с надмуравьи-ной кислотой и аль-циановым синим

Реакция с надмуравьи-ной кислотой и псев-доизоцианином

-SH

-S-S--SH

S-S--SH

Barrnett, Selig-man (1954)

Высокая

Adams, Sloper (1956)

Schiebler, Schies-sler (1959); Sterba (1964)

Очень низкая

Низкая

Окисление иодом 0,1 М моно-иодацетат 0,1 MN-этил-малеимид

Специфична (исключение: окрашивание эластических волокон в результате их сродства к нафтолу); возможна количественная оценка содержания SH-групп в срезах ткани

Низкая чувствительность обусловливает избирательное выявление веществ с высоким содержанием серы

Отличный способ выявления SH- и S-S-групп в нейромедиа-торах, а также в инсулине

80- 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

Ъ~ 5Н + ClHf--(^^N=?N-

H-5He^^^N?N-^y + HCl

рн

2. Диоксидш1афт11лдирул}ф|д (ДДДЬреакния для выявления связанных с белками сулъфгидвильных групп по Бярне-ту и Зелигману (Barraett, SeJigman, 1952, 1953)

Специфический дисульфид (ДДД-реагент), синтезированный Барнетом и Зедигманом, образует со связанными SH-группами белка при щелочном рН (8,5) бесцветное соединение, которое нерастворимо ни в воде, ни в органических растворителях, В результат? сочетания с солью диазо-ния образуется азохраситель;

'—мххх,..ххУ

I

белок -S-

л щ

Тетраазотированный дио/тнтзнШш

(Окрашенный конечный f

?

белок

_4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов 81

ДДД-реакция позволяет проводить количественны© ми-кроспектрофотометрические измерения содержания SH-групп в срезах тканей, ДДД-реагент может, кроме того, использоваться для химического определения SH-групп в белках.

Помимо описанного метода выявления SH-групп, с помощью ДДД-реакции можно проводить общее определение SH' и S - S-групп, а также отдельно S - S-групп. В первом случае содержащиеся в срезах S - S-группы восстанавливают до SH-групп, а затем одновременно с уже имеющимися в срезах SH-группами выявляют при помощи ДДД-реагента,

Выявление отдельно S — S-групп проводится в два этапа. Сначала блокируют имеющиеся в тканях активные SH-группы (например, иодадетатом или N-этилмалеимидом), затем восстанавливают диеульфидные группы до SH-групп и выявляют последние гистохимически.

3. Метод окисления надмуравьиной кислотой для выявления S—S и SH-групп по Пирсу (Pearse, 1951)

В этом методе цистин окисляется надмуравьиной кислотой. Образующиеся сульфиновые (HS02), сульфоновые (HS03) или альдегидные группы реагируют с реактивом Шиффа. HS02 и HS03 -группы можно определять также методом измерения базофилии, Структуры, которые в отличие от необработанных контрольных препаратов после окисления надмуравьиной кислотой связывают метиле-новый синий при рН 2,8, должны содержать S — S- или SH-группы.

R-S-5-й + 6 Н-СООН + НгО -* 2R-SO,0-H+ + 5 И СООН

Цистин Надмуравьиная кислота

Цистеиновая Муравьиная кислота кислота

Предполагается, что альдегидные группы, образую-диеся из этиленовых групп липидов в результате окисле-

82 4. Гистохимия отдельных классов веществ и ферментов

ния надмуравьиной кислотой, также реагируют с реактивом Шиффа.

—СН=СН— + 2Н • О • С ОН -+ 2—СНО + 2Н СООН

Этиленовая Надмуравьиная Альдегид Муравьиная связь кислота кислота

Вследствие этого в условиях данной реакции определение базофилии является более предпочтительным, чем применение реактива Шиффа. Вслед за окислением надмуравьиной кислотой в течение 24 ч при 25°С срезы помет щают в 5-10-4 М раствор метиленового синего, забуфе-ренный глициновым буфером до рН 2,8, заключают под покровное стекло в дистиллированной воде и сразу исследуют под микроскопом. Хорошие результаты достигаются путем окрашивания основными красителями альциа-новым синим и астрасиним (растворенными в 2 н. H2S04).

Преимущество метода окисления с последующим окрашиванием альциановым синим и астрасиним основано на избирательном окрашивании структуры с содержанием цист

страница 12
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54

Скачать книгу "Основы гистохимии" (3.96Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)