ейным процессом, происходящим в узкой области концентраций. Это свидетельствует о том, что активация 1сгас является, по-видимому, процессом, работающим по принципу "все или ничего" (Parekh et al., 1997; Huang, Putney, 1998).

В последнее время разработаны методы одновременной регистрации активности crac-каналов (в режиме пэтч-кламп в конфигурации"\упо1е cell") и концентрации Са-" в ЭР с помощью зонда Mag-Fura 2-АМ (Hofer et al., 1998). Обнаружено, что с помощью нового проникающего через мембрану Са2*-хелатора N, N, N1, N'-тетраки (2-пиридилметил) этилендиамина (TPEN) можно фиксировать концентрацию Са"* в депо на любом заданном уровне в течение 10-15 с, не влияя на активность Са"*-насосов или каналов Са*+-выброса. Показано, что: 1) 1сгас активируется исключительно при уменьшении концентрации свободного Са~* в депо; 2) амплитуда 1сгас коррелирует со степенью опустошения депо; 3) не существует порога опустошения депо для активации 1сгас. Более того, обнаружено, что кинетика инактивации 1сгас относительно медленная и зависит, по-видимому, от растворимых факторов, которые теряются при работе в режиме "whole cell". По мнению авторов, отсутствие порога активации и медленная скорость инактивации 1сгас не согласуются с моделями, предполагающими белок-белковые взаимодействия, и свидетельствуют о существовании относительно медленного метаболического этапа, ответственного за включение и выключение емкостного входа Са"* (Hofer et al., 1998).

Основным Са"*-связывающим белком во внутриклеточных депо невозбудимых клеток является кальретикулин. При экспрессии кальретикулина в L фибробластах наблюдается увеличение содержания Са2+ в тапсигаргин-чувствительных Са"+-депо и существенное подавление депо-зависимого входа Са2', вызванного тапсигаргином (Mery et al., 1996). Предполагают, что кальретикулин активно участвует в регуляции емкостного входа Са"+ в клетки.

В плазматической мембране клеток эпидермоидной карциномы А431 (Kiselyov et al., 1997b) и перитонеальных макрофагов мыши (Kiselyov et al., 1997а; Семенова и др., 1998) идентифицированы Са2*-каналы, прямо активируемые 1Р3. Авторы назвали эти каналы Imin (miniature Са2+ channels). Каналы имеют очень низкую проводимость (1 пСм), высокую селективность для Са~* относительно К* (Ро/Р^ЮОО); вероятность их открытого состояния возрастает при гиперполяризации мембраны. Указанные свойства отличают эти каналы от 1РГ активируемых каналов ЭР, но позволяют отнести их к семейству crac-каналов. С другой стороны, 1Р3-чувствительные каналы в плазматической мембране исследованных клеток имеют свойства, характерные для 1Р3-рецептора ЭР: дозо-зависимость эффекта 1Р3, 1Р3-з.авидимую десенситизацию рецептора, чувствительность к блокирующему действию гепарина и арахидоновой кислоты. Предполагают, что (Реактивируемые Са" -каналы в плазматической мембране могут непосредственно регулироваться IP,-рецептором в мембране ЭР. 1Р3-рецептор связывается с 1Р3, изменяет конформацию и передает сигнал с ЭР к высокоселективному Са"'-каналу в плазматической мембране (Семенова и др, 1998). Эта точка зрения согласуется с моделью "конформационного связывания".

Состояние покоя

Рис. 40. Модель функционального связывания Са2+-канала (1тт) с комплексом 1Р3-рецептор (IP3R) - Р1Р2.

¦ А. В состоянии покоя популяция 1Р,-рецепторов, расположенных под плазмалеммой, образует ингибиторный комплекс с Р1Рт. локализованным в плазматической мембране. Эти 1Р3-рецепторы прямо или опосредованно связаны также с Са'-каналами (1„,1П) в плазматемме. В. Стимуляция клеток агонистами вызывает активацию фосфолипазы С (PLC), расщепление связи 1Р3-рецептор - Р1Р2, образование 1Р3 и изменение конформации 1Р3-рецептора. Изменение конформации 1Р3-рецептора приводит к активации Са"1-каналов (lm,n) И входу Са"* В клетку (по Kaznacheyeva et al., 2000). Далее эти же авторы на клетках А431 показали, что 1пш, в мембранных фрагментах "inside-out" действительно регулируется 1Р3-рецепторами, входящими в состав микросом мозжечка крысы, и блокируется соединением SKF 95365, ингибирующим Icrac (Zubov et al., 1999). Полученные данные свидетельствуют о сходстве между 1т1-п и сгас-каналами и являются веским аргументом в пользу модели "конформационного связывания".

На мембранных фрагментах "inside-out" клеток А431 обнаружено также, что активность 1тш существенно возрастает в присутствии антитела к Р1Р2 и уменьшается при добавлении PIP2 (Kaznacheyeva et al., 2000). Предполагают, что активация 1тт в клетках А431 происходит путем их прямого конформационного связывания с определенной популяцией 1Р,-рецепторов, расположенных под плазматической мембраной, и связанных с PIP; (рис. 40).

В пользу модели "конформационного связывания" свидетельствуют также данные, полученные на клетках линии НЕК 293 с использованием метода пэтч-кламп и молекулярно-биологических методов (Kiselyov et al., 1998). Авторы экспрессировали в клетках НЕК 293 Htrp 3-белки, образующие депо-зависимые Са**-каналы (Zhu et al., 1996). Показано, что Htrp 3-каналы находятся в тесном функциональном взаимодействии с 1Р3-рецепторами. Htrp 3-каналы активируются Са2+-мобилизующими агонистами в интактных клетках или приложением 1Р3 к мембранным фрагментам "inside-out". Активирующее влияние 1Р3 на Htrp 3-каналы блокируется гепарином или проникающим через мембрану ингибитором 1Р3-рецепторов ксестоспонгином С. Обнаружено также, что активирующее действие 1Р3 на Htrp 3-каналы исчезает при длительном отмывании мембранных фрагментов, но может быть восстановлено при добавлении нативных или рекомбинантных 1Р3-рецепторов, связанных с 1Р3. Полученные данные свидетельствуют в пользу модели конформационного связывания, в соответствии с которой 1Р3-рецепторы, активированные 1Р3, взаимодействуют с депо-зависимыми Са "-каналами (Kiselyov et al., 1998). В последующей работе эти авторы показали, что для активации Htrp 3-каналов важен N-терминадьный (1Р3-с,вязываюцшй) домен 1Р3-рецептора (Kiselyov et al., 1999).

5.3.2.4. Молекулярная природа депо-зависимых Са2+-ка