Биологический каталог




Основы ферментативной кинетики

Автор Э.Корниш-Боуден

аций субстрата покажется проведенной некорректно. Аналогичная ситуация возникает и при использовании двух других линейных графиков, однако в этих случаях данному вопросу не придают особого значения.

1 Еще Хейнс [70] в своей первой работе, где он использовал линейную анаморфозу уравнения Михаэлиса — Ментен, указывал на возможность статистического разброса. Однако он не придал этому особого значения, что вполне оправданно при использовании уравнения (2.12), для которого разброс незначителен. К сожалению, при переходе к уравнению (2.14) и соответствующему ему графику двойных обратных величин ситуация меняется.

I

48

Глава 2

Представление данных в координатах {v;vls}maeei тот недостаток, что v, обычно рассматриваемая как зависимая переменная, входит как в величину, откладываемую по оси ординат, так и в величину, откладываемую по оси абсцисс. Вто же время график зависимости si v от s свободен от этого недостатка и является по-•этому самым удовлетворительным из всех /грех линейных графиков.

Эйзенталь и Корниш-Боуден [50] предложили недавно принт ципиально иной метод графического 'представления результатов исследования кинетики ферментативных реакций; их график был назван ими прямым линейным графиком. Вместо обычной формы записи уравнения Михаэлиса—Ментен в виде зависимости и вт s авторы используют преобразованную форму — зависимость V от ifM:

V = v + -^Kk. (2.15) s

Таким образом, для любой пары значений s и v можно построить зависимость V от Км', зависимость представляет. собой прямую с наклоном, равным vis, и отрезками, отсекаемыми на осях jR"mhF, соотвественно равными —s и v. Эта прямая связывает вей

Рис. 2.7. Прямой линейный график (график зависимости V от Км).

Каждая прямая соответствует одному наблюдению и проведена таким образом, что отре-аок, отсекаемый ею на оси абсцисс," составляет —s, а на оси ординат — v. Координаты

точки пересечения дают значения /Cjj и V, позволяющие наилучшим образом описать

экспериментальные данные.

'ведение в ферментативную кинетику

49

значения V и г\м\которые точно удовлетворяют выбранной паре значений s и v. Бели подобным образом провести прямые для нескольких пар значений s и v, то эти прямые пересекутся в одной точке, координаты которой дадут единственные значения V и Km удовлетворяющие всем парам значений s и v (рис. 2.7). В реальном эксперименте положение точки пересечения определяется менее точно, чем в идеальном случае, представленном на рис. 2.7, из-за экспериментальной ошибки. Однако не представляет особого труда- найти оптимальную точку пересечения, где прямые располагаются наиболее плотно. Подобным методом очень просто выявить ошибочные данные, поскольку соответствующие прямые будут выпадать из основной совокупности прямых. Самое очевидное преимущество прямого линейного графика по сравнению с другими линейными графиками состоит в том, что для его построения не требуется никаких расчетов, даже расчетов, по определению обратных значений. Этот график обладает также определенными достоинствами с точки зрения статистической обработки результатов, что будет обсуждено в разд. 10.9.

2.6. Механизм Михаэлиса — Ментен для обратимой ферментативной реакции

Все реакции, в том числе и многие реакции, имеющие большое значение для биохимии, в принципе являются обратимыми в том смысле, что в равновесных условиях ни концентрации субстратов, ни концентрации продуктов нельзя считать пренебрежимо малыми. Ясно поэтому, что механизм Михаэлиса—Ментен в том виде, в котором он приведен выше, является неполным: для этого необходимо ввести стадию, соответствующую обратной реакции.

Е +А^ЕА^'Е + Р. (2.16) е0 — х - а х е0 — х р

(Рассматривая реакции, протекающие с участием более чем одного субстрата, нецелесообразно применять символ S для обозначения какого-либо отдельного субстрата; лучше сохранить его для обозначения субстратов как таковых. В общем случае субстраты прямой реакции мы обозначаем буквами А, В, а обратной — буквами Р, Q, ... .) Условие стационарного протекания процесса выражается теперь следующим образом:

d,xfdt = А+1 (е0 — х) а + (е0 — х)р — (k_{ + k+z) х = 0.

50

Глава 2

Преобразуя это выражение, получаем _ fc+i g0 д + fe-2 go P

fc_l + fc+2 + fc+1 a + k-iJ

Суммарная скорость образования P представляет собой разность между скоростями прямой и обратной реакции

v = fc+2 х — к_2 (е0'— х) р.

Подставляя в это уравнение выражение для х, получаем

v _ fc+i fc+2 еоа — fc-i fc-2 eo P ^2 fc_i + fc+2 + fc+iа + к_йр '

В частном случае при р = 0 мы приходим к полученному выше уравнению (2.7) (хотя величина а должна быть заменена на с0, поскольку строго скорость можно считать начальной только в начальный момент времени). В то же время в частном случае при а = 0 получаем соответствующее выражение для начальной скорости обратной реакции

v _ — fc_i fc«-2 ео Po_

fc_l + fc+2 + fc_2 PO

Как и выражение для скорости прямой реакции, это уравнение совпадает по форме с уравнением Михаэлиса — Ментен [уравнение (2.8)], и поэтому мы можем ввести следующие обозначения для максимальной скорости и константы Михаэлиса обратной реакции:

Аналогичным образом вводятся обозначения для V и Км в случае прямой реакции:

< = №-1+-М^+1-

Используя эти четыре обозначения, можно переписать уравнение (2.17) в виде

V,a VrP

'ведение в ферментативную кинетику

51

Это уравнение представляет собой уравнение Михаэлиса — Ментен в общем виде, справедливое для обратимой ферментативной реакции. Его преимущество ш» сравнению с уравнением (2.17) состоит в том, что оно не связано ни с каким конкретным механизмом и его можно рассматривать как чисто эмпирическое уравнение. Иными словами, существует много механизмов, более сложных, чем механизм (2.16), которые тем не менее описываются уравнением скорости типа (2.18). Наиболее важным среди этих механизмов является механизм обратимой ферментативной реакции, который наиболее близок к реальной ситуации, поскольку в нем стадия превращения А в Р и стадия высвобождения продукта Р из комплекса с ферментом рассматриваются как отдельные реакции:

Е +А^ЕА^ЕР^ Е +Р. (2.19)

А_,

е0—х — у а х у е0 — х — у р

Уравнение стационарной скорости можно получить, приравнивая к нулю скорости измерения концентраций обоих промежуточных соединений:

dxldt &+1 а (е0 — х — у) 4- к_2 у — (k_t й+2) х = О, dy/dt = k_a р (е0 — х — у) + ft+s х — (к_г + &+s) у = О и решая полученную систему уравнений относительно х и у:

х__Ki (fc-a + Ka) еаа + Кг Ks «»P_

Kik_t + fc-ifc+s+fc+s^+s 4- Ki + ha + Ka)a+(k-i + hi + Kz) к~зР '

y_ _Ki Ks gp° + (hi + hi) Ks UP_

hxh% + hiha+hzhs+ hi (Kz + Ka + Ks) a+(k-i + Ki + ha) к-зР '

Суммарная скорость представляет собой разность скоростей прямой и обратной реакций для любой стадии, например

v = к^х — к_?у -----

__fc+i fc+2 Кз еоа — KiKtKs UPi_

KiKa + hihe + hahs + Кг (Кц + Кз + Ks) а + (hi + Кг + Кг) КаР '

Это уравнение по форме совпадает с уравнением (2.18), однако параметры У и /См для прямой и обратной реакций определяются теперь следующим образом:

hs "f" ^+2 ~Ь ^+3 Т/ _ ^-1 ^-2 е0

hi -f- k_2 + k+2

52 Глава 2

М _ fc_a 4- fe-i fc+з 4c fc+2 fc+з/

4 *+2 4 fc+з)/ 'P _ fe-i 4 fe-i fc+з 4fe+2,^+8

tfM = Ц^-^'-'Ч'11"*1^ , (2.20) fc+i (fc-2 4 fc+i 4 fc+з)/

Km = 1 T -1 +3 ТЧ,Л* . (2.21)

Уравнение (2.20) выглядит довольно сложно, но, если константа й+2 мала по сравнению с величиной (А_а+ к+3), его можно упростить: Км = k-JKi = (где К* — истинная константа диссоциации комплекса ЕА). Аналогичным образом если к_2 мала по сравнению с (k_t -f- й+2), то Км (&Kf. Оба эти приближения могут выполняться одновременно, если справедливы неравенства fc+2 <с <3 А+а.и fc_2 k_i или, иными словами, если стадия превращения ЕА +± ЕР является лимитирующей для обоих направлений реакции.

В равновесных условиях суммарная скорость реакции равна нулю, поэтому из уравнения (2.18) следует, что

= 0

(воо и Ре, — равновесные значения величин вир). Отсюда

У/Км Роо „

~-= А,

У г Км

где К — константа равновесия ферментативной реакции. Это соотношение является очень важным и известно как соотношение Холдейна [64]. Оно выполняется не только для простого механизма Михаэлиса—Ментен, но и для любого механизма, приводящего к уравнению скорости типа (2.18). Если уравнение скорости имеет более сложный вид (например, уравнений скорости для механизмов, включающих несколько субстратов), соотношения Холдейна также выглядят сложнее, однако следует подчеркнуть, что в любом случае между кинетическими параметрами и константой равновесия должно существовать по меньшей мере одно соотношение подобного типа.

Соотношение Холдейна на самом деле является обобщением уравнения, использованного ранее фон Ойлером и Джозефсоном [52] для сопоставления кинетических параметров ферментативного гидролиза 6-метилглюкозы с константой равновесия для ферментативной реакции. Однако значение этого соотношения не было должным образом оценено до тех пор, пока Бок и Альберти [13] не применили соотношение Холдейна для анализа кинетических параметров ферментативной реакции, катализируемой фумаразой1.

1 Рекомендуемое в настоящее время тривиальное название — фумарат-гидратаза (КФ 4.2.1.2). — Прим. перев.

Введение в ферментативную кинетику

53

После этой работы проверка выполнимости соотношения Холдей-на для получаемых результатов стала обычной процедурой, позволяющей избежать ошибок при интерпретации кинетического механизма (если, конечно, удается наблюдать как за прямой, так и за обратной реакцией).

-

2.7. Ингибирование продуктом

Ингибирование продуктом представляет собой просто особый случай ингибирования, механизмы которого детально будут рассмотрены в гл. 5. Однако, учитывая то обстоятельство, Что ингибирование продуктом естественно вытекает из проведенного в предыдущем разделе обсуждения, целесообразно кратко рассмотреть этот вопрос в настоящей главе. Если уравнение (2.18) выполняется, то скорость реакции должна уменьшаться по мере накопления продукта даже в

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

Скачать книгу "Основы ферментативной кинетики" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.06.2019)