Биологический каталог




Основы ферментативной кинетики

Автор Э.Корниш-Боуден

нимать во внимание начальную стадию реакции, протекающую в течение первых долей секунд после смешивания), можно рассматривать как доказательство того, что, как правило, величина (fc+ts + + й+2) намного больше, чем 1 с"1.

Уравнение вида (2.9) было получено Лейдлером [100] как частный случай, вытекающий из более общего подхода, чем прит веденный выше. Лейдлер рассмотрел ситуацию, когда реакция протекает достаточно долго и вследствие этого концентрация субстрата понижается настолько, что допущение о постоянстве s и равенстве ее s0 (начальной величине s) перестает выполняться. Он нашел, что в этом случае система достигает стационарного состояния, в котором

х' =-*+1ео(»о-р) . (2.10)

fc-i + fc+*+fc+l(so — Р)

и, следовательно,

V = fc+lfc+2gofa)— Р) = У(*0 — Р) /?

fc_l+fc+2+fc+l(»0 — Р) КМ + *0 — Р' '

Уравнения (2.10) и (2.11) идентичны уравнениям (2.6) и (2.8), за исключением того, что величина s в последних уравнениях заменена на (s0—р). На первый взгляд может показаться, что нелогично говорить о стационарном состоянии, в котором х выражено через зависимую от времени величину р. Этот парадокс легко разрешить, если принять во внимание тот факт, что зависимость х от времени, описываемая уравнением (2.10), дает менее

42

Глава 2

значительные изменения этой величины, чем в переходной фазе, т.е. за время достижения стационарного состояния. Исходная точка зрения Бриггса и Холдейна мало изменится, если заменить допущение dxldt = 0 тем, что dxldt очень мала: уравнение (2.5) перестает строго выполняться и становится просто хорошим приближением.

10

0,8

о _

Q4

0,2

Oh 10

Переходный участок [уравнение (2.9)]

Стационарный участок

часток начальноиИ/часток основного протекания реакции [уравнение (2.11)]

[скорости [уравнение (2.8)]

10~z Ю"' 1 10 102 103 10

Рис. 2.2. Временной ход реакции, подчиняющейся механизму Михаэлиса

Ментен, при следующих значениях параметров: к

1000

1+2

100

+1. -

10' М^-с

0; so = 2-10~« Ми е0 - 10"8 М.

Резюмируя все изложенное выше, можно сказать, что кинетическая кривая ферментативной реакции обычно состоит из трех участков, четко разграниченных по времени, как это показано на рис.2.2. Первый, переходный участок описывается уравнениями, сходными с уравнением (2.9); более детально он рассмотрен в гл. 9. Второй участок (участок начальной скорости) является единственным, для которого скорость процесса Действительно, постоянна. После опубликования работы Михаэлиса и Ментен большая часть исследований была посвящена изучению именно этого участка кинетической кривой. Наибольшее внимание уделено ему и в настоящей книге. Для описания конечного участка, где концентрации субстрата и продукта существенно изменяются и скорость процесса снижается до нуля, требуются уравнения, сходные с уравнением (2.11); обычно они применяются в интегральной форме. Этот участок рассмотрен в гл. 8.

До сих пор при выводе уравнений скорости мы полагали, что So ^ е<> (подобная ситуация обычно имеет место на практике при

Введение в ферментативную кинетику

43

исследовании стационарных участков кинетических кривых). Лейдлер [100] рассмотрел вопрос о том, к чему приведет допущение о стационарном протекании реакции при менее жестких ограничениях. Он пришел к выводу, что при выполнении по крайней мере одного из следующих допущений:

(l)s0>e0; (2)e0^s0; (3) (Al4 + fc+2) > е0;

(4)(fc_1 + fc+2)»fc+1s0

уравнение скорости принимает вид, несколько отличный от уравнения (2.11):

v_ V(s0-P)

+ e0 + s0 — p

Поскольку экспериментатор, как правило, имеет большую свободу в выборе значений е0 и s0, добиться выполнения хотя бы одного из этих условий не составляет труда.

В заключение отметим, что при обсуждении принципа стационарности мы не касались эффекта ингнбирования продуктом реакции, которое может иметь место. Это явление рассматривается в разд. 2.7.

2.5. Графическое представление уравнения Михаэлиса — Ментен

Результаты измерений начальных скоростей при различных концентрациях субстрата удобнее всего представлять графически, с тем чтобы можно было оценить значения кинетических параметров и точность эксперимента. Самый простой способ графического представления данных, описываемых уравнением (2.8), состоит в построении графика зависимости v от s; в результате получается равнобочная гипербола (рис.2.1) с асимптотой v = V для ординаты v и с асимптотой s = —/См Для абсциссы s. Однако для практических целей этот график оказывается наименее пригодным; обусловлено это тем, что, во-первых, довольно трудно точно построить равнобочные гиперболы; во-вторых, определенные трудности возникают и при построении асимптот: всегда хочется провести их как можно ближе к кривой; в-третьих, трудно проводить сопоставление гипербол между собой и, в-четвертых, очень трудно обнаружить отклонения от ожидаемой кривой, если они существуют. Михаэлис и Ментен [113], отдавая себе отчет во всех этих трудностях, строили график в координатах (v; lgs). Этот график, как видно из рис. 2.3, представляет собой симметричную S-образную кривую, которая имеет максимальный наклон при s — /См- Дифференцирование уравнения (2.8) показывает, что

dv KM Vs

dins (ЙГМ -f s)* '

44

Глава 2

или

dv 2,303 KMVs digs ~ (KM+s)*

Максимальный наклон имеет место при s =/См» он равен 2.303F/4, т.е. 0.576F. Следовательно, V можно рассчитать, разделив значение максимального наклона на 0,576.

Рис. 2.3. Определение параметров V и Км методом Михаэлиса и Ментен. Для достаточно большого интервала значений скорости зависимость о от lg (s//Cm) является почти линейной, что позволяет без труда найти максимальный наклон.

Михаэлис и Ментен определяли затем константу /См как значение s, при котором скорость составляет половину V. Подобный способ расчета дает более точное значение /См» чем оценка, основанная на нахождении точки максимального наклона кривой. В настоящее время этот график обычно не применяется, однако он представляет интерес по ряду соображений. Во-первых, он подчеркивает взаимосвязь между насыщением белка субстратом и ионизацией кислоты (последняя представляется кривой титрования — зависимостью степени ионизации от рН); во-вторых, этот график удобен для представления в более общей форме данных по насыщению белков, имеющих несколько связывающих центров; в-третьих, он характеризуется меньшим разбросом данных, чем линейные графики (которые будут рассмотрены далее), хбтя результатом наблюдений в середине интервала концентраций субстрата придается большее значение при расчете параметров, чем на его краях; наконец, этот график представляет исторический интерес.

Введение в ферментативную кинетику

45

После опубликования работы Лайнуивера и Бэока [1061 большинство исследователей стали использовать уравнение Михаэлиса—Ментен в\ форме, позволяющей представлять результаты в виде прямой. Линеаризацию можно проводить тремя способами:

к

м

v = V~ 1 1

s К

м

Vs

(2.12)

(2.13) (2.14)

Рис. 2.4. График зависимости s/v от s. Вертикальные отрезки соответствуют ошибке измерения v, составляющей ±0,05V.

В первом случае зависимость s]v от s графически изображается прямой с наклоном 11V и отсекает на осях slv и s отрезки KwJV f и —Км соответственно. Аналогичным образом, откладывая v от vis и 1/и от lis, строят линейные графики зависимостей (2.13) я (2.14). Все три графика изображены на рис. 2.4—2.6.

Уравнение, совпадающее по форме с уравнением (2.12), было предложено Лэнгмюром [103], когда он изучал адсорбцию газов на твердых поверхностях, и было введено в ферментативную кинетику Хейнсом [70]. Этот автор использовал уравнение для

Рис. 2.6. График зависимости 1/v от 1/s (график Лайнуивера—Бэрка, или график двойных обратных координат). Вертикальные отрезки соответствуют ошибке измерения о, составляющей ±0,05V.

Введение в ферментативную кинетику

47

анализа своих результатов, которые, однако, не были представлены графически. Две другие линейные анаморфозы и все три графика были введены Вульфом [153]. Широкую известность они получили лишь после Лайнуивера и Бэрка [106], а также Эди [47] и Хофсти (77 ]. Наиболее часто применяется график двойных обратных координат {1/v; Us}, обычно называемый графиком Лайнуивера—Бэрка. Однако, поскольку он является также и наименее точным, от его использования следует воздержаться.

До 1961 г. обсуждение относительных достоинств трех линейных графиков касалось в основном вопросов о том, насколько они удобны и как четко выявляют отклонения от уравнения Михаэлиса—Ментен. Пока обсуждение ограничивалось рассмотрением только этих вопросов, никаких серьезных доводов, позволяющих отдать предпочтение какому-либо линейному графику, фактически не существовало. Это положение убедительно подтверждается результатами обобщений, проведенных Диксоном и Уэббом (см. [78]). Совсем недавно Уилкинсон [149], с одной стороны, и Иоханес и Ламри [86], с другой, поставили вопрос о статистическом разбросе данных для всех линейных анаморфоз уравнения Михаэлиса—Ментен1. Полученные этими авторами результаты и соответствующие выводы детально рассмотрены в гл.10, однако некоторые важные моменты стоит отметить здесь. Для определения параметров, строго говоря, вообще нецелесообразно использовать графики (линейные или любые другие). Для этой цели следует применять ЭВМ (см. гл. 10), а один из линейных графиков можно представлять далее только для иллюстраций. Иногда высказывается точка зрения, что, поскольку неудовлетворительными являются все три графика, имеет смысл использовать наиболее привычный из них — график двойных обратных координат. Однако это предложение противоречит принципу, гласящему, что задача правосудия состоит не только в том, чтобы добиться справедливости, но и в том, чтобы показать, каким путем оно этого добилось. Если результаты эксперимента представить в двойных обратных координатах и здесь же показать линию, полученную путем независимых (не дающих, очевидно, разброса) вычислений, то эта расчетная линия из-за больших отклонений ряда точек в области малых концентр

страница 8
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

Скачать книгу "Основы ферментативной кинетики" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.08.2019)