Биологический каталог




Основы ферментативной кинетики

Автор Э.Корниш-Боуден

но низких температурах скорость реакции с участием этого фермента примерно удваивается при повышении температуры на 10°С. Однако в отличие от большинства обычных химических реакций для реакции, катализируемой инвертазой, наблюдается отчетливо выраженный температурный оптимум, и при температурах выше оптимальной скорость быстро падает до нуля. Было доказано, что инвертаза является истинным катализатором, поскольку в ходе

1 Рекомендуемое в'настоящее время тривиальное название — Р-фрукто-фуранозидаза (КФ 3.2.1.26) (см. Номенклатура ферментов, ВИНИТИ, М., 1978). — Прим. перев.

32

Глава 2

реакции она не разрушается и не изменяется. Кроме того, препарат фермента сохранял активность после проведения каталитического гидролиза сахарозы, взятой в количестве, превышающем вес фермента в 100 ООО раз. Наконец, термостабильность фермента была во много раз выше в присутствии своего субстрата, сахарозы, чем в его отсутствие. Как отмечали авторы, «в присутствии тростникового сахара инвертаза выдерживала без потери активности температуру на целых 25°С выше, чем в его отсутствие; зто чрезвычайно интересный факт, и, насколько мы можем судить, его можно объяснить единственным образом: инвертаза вступает в комбинацию с сахаром». К аналогичному заключению пришел Вюртц [155], который, изучая катализируемый папаином гидролиз фибрина, наблюдал появление осадка, представляющего собой, по его мнению, соединение папаина с фибрином, выступающее в роли промежуточного соединения при гидролизе.

Идея фермент-субстратного комплекса приобрела чисто кинетический смысл благодаря работе Брауна [22]. Как и ряд других исследователей, Браун установил, что скорости ферментативных реакций не соответствуют скоростям реакций второго порядка. Прежде всего он показал, что скорость гидролиза сахарозы при брожении, осуществляемом живыми дрожжами, не зависит от концентрации сахарозы. Противоречию между результатами Брауна, полученными с живыми дрожжами, и результатами О'Сул-. ливана и Томпсона для выделенного препарата инвертазы не придавали особого значения, поскольку считалось, что катализ изолированными ферментами принципиально отличается от брожения, осуществляемого живыми организмами. Однако открытие Бухнера [24], показавшего, что бесклеточный (т.е. неживой) экстракт дрожжей может катализировать спиртовое брожение, заставило Брауна [23 ] проверить свои более ранние результаты. Убедившись прежде всего в том, что они корректны, Браун показал, что аналогичные данные можно получить и для очищенной инвертазы. На основании этого он сделал предположение, что если имеет место механизм с образованием, фермент-субстратного комплекса, то скорость реакции не может превышать некоторого предельного значения. При условии, что до своего каталитического распада комплекс существует в течение какого-то промежутка времени, скорость должна достигать максимального значения при такой концентрации субстрата, которой в соответствии с законом действующих масс достаточно, чтобы перевести весь фермент в комплекс. При меньших концентрациях субстрата существенное значение приобретает скорость образования комплекса, и поэтому скорость гидролиза будет зависеть от концентрации субстрата.

Анри [73,74 ] высказал критические соображения по поводу модели Брауна в связи с тем, что в этой модели время жизни фер-

Введение в ферментативную кинетику

33

меят-субстратного комплекса (т.е. время, прошедшее с момента внезапного возникновения комплекса до его распада) принимается фиксированным. Анри предложил механизм, который в принципе сходен с механизмом Брауна, но сформулирован в более четких математических и химических терминах и включает равновесие , между свободным ферментом и фермент-субстратным и фермент-продуктным комплексами. Анри показал, что независимо от того, постулируем ли мы в качестве промежуточного вещества реакции один из этих комплексов или оба, схема, в которой продукты образуются путем распада фермент-субстратного комплекса,

E+S^ES-^E-f-P, .

и схема, когда свободный фермент выступает в роли вещества, обладающего активностью, в реакции второго порядка

ES И

Е + S Е + Р,

с кинетической точки зрения равноценны. Последняя схема в настоящее время не рассматривается как реальная и применяется очень редко (например, Вайелом [145]). Однако она соответствовала идеям того времени, что катализатор действует только своим присутствием. Кроме того, исследования Анри привели к мысли о том, что одно и то же уравнение скорости можно получить, рассматривая несколько разных механизмов протекания ферментативной реакции (подобную ситуацию иногда называют гомеоморфизмом). Это обстоятельство следует учитывать при интерпретации результатов кинетических измерений.

Интересно, что Анри в своей схеме допускал образование комплекса фермент—продукт и Что в полученном им уравнении уже заложена идея конкурентного ингнбирования продукта:

v =-Ь-. (2.1)

s р

В этом выражении v — скорость; е0 — общая концентрация фермента; вир — концентрации свободного субстрата и свободного продукта соответственно; к, К« й КР — константы. При р = О уравнение (2.1) дает значение начальных скоростей для различных концентраций субстрата. Более общая форма уравнения скорости, использованная Анри, особенно удобна для описания полученных им экспериментальных данных, поскольку он, как и другие исследователи того времени, следил за ходом реакции в течение достаточно больших. интервалов времени. Тем не менее уравнение

2—282

34

Глава 2

Анри является неполным, потому что оно не учитывает всегда имеющей место обратной реакции: зто уравнение предполагает торможение прямой реакции вследствие накопления продукта, которое, однако, не препятствует полному протеканию реакции. В уравнении, учитывающем более реальную ситуацию [например, в приведенном ниже уравнении (2.18) ], допускается возможность того, что реакция при равновесии не доходит до конца.

2.2. Работа Михаэлиса и Ментен

Хотя Браун и Анри пришли по существу к правильным выводам, они опирались на эксперименты, постановка которых вызывала серьезные возражения.'О'Сулливан и Томпсон никак не могли получить согласующиеся результаты до тех пор, пока они не осознали, как важно учитывать концентрацию кислоты. Браун выделял фермент другим способом и пришел к выводу, что добавлять кислоту не обязательно (возможно, использованные им растворы были слабо забуферены природными соединениями, содержащимися в дрожжах), а Анри совсем не обсуждал этого вопроса. Если не считать О'Сулливана и Томпсона, то в ранних исследованиях действия инвертазы использовались условия, препятствующие протеканию мутаротации глюкозы, образующейся в реакции, хотя этот процесс, несомненно, оказывал влияние на получаемые результаты.

После введения Сёренсеном понятия концентрации водородных ионов, выражаемой в логарифмических единицах шкалы рН [134], Михаэлиси Ментен [113] пришли к выводу о необходимости проведения решающих экспериментов с инвертазой. Эти исследователи регулировали рН реакции при помощи ацетатных буферов, использовали условия, препятствующие протеканию мутаротации продукта, и измеряли начальные скорости реакции при различных концентрациях субстрата. В том случае, когда используются начальные скорости, обратной реакцией и другими эффектами продукта можно с полным основанием пренебречь и, следовательно, применять значительно менее сложное уравнение скорости. Несмотря на более строгую постановку эксперимента, Михаэлис и Ментен получили результаты, удовлетворительно согласующиеся с результатами Анри. Михаэлис и Ментен оценили заслуги Анри и Брауна, сформулировав следующий обобщающий механизм:

E + S*±ES-»-E-fP.

Так же как и Анри, Михаэлис и Ментен сделали допущение, что первая, обратимая стадия является достаточно быстрой и поэтому может быть охарактеризована константой равновесия Ks— = es/x, где х — концентрация промежуточного соединения

Введение в ферментативную кинетику

35

ES; следовательно, х =es/Ks. Однако мгновенные концентрации свободного фермента и субстрата нельзя измерить непосредственно, и поэтому их нужно выразить через доступные измерению начальные концентрации е0 и Sq:

s0 = s + x.

Из первого из этих соотношений следует, что х не может быть больше е0. Поэтому, если *0 намного превышает е0, она должна быть также значительно больше, чем х. Следовательно, с хорошей точностью выполняется равенство s = s0. Тогда выражение для х принимает следующий вид:

ж = (е0 — x)s/Ks.

Его можно преобразовать к виду

х =

Вторая стадия реакции, ES -> Е + Р, является простой реакцией первого порядка с константой скорости k+i, поэтому

v = k.sx = —^fS— = . k+*e°s , (2.2)

Это уравнение в частном случае, когда р = 0, идентично уравнению (2.1), полученному Анри.

Михаэлис и Ментен показали, что предложенная теория и уравнение (2.2) могут полностью объяснить результаты, полученные ими для инвертазы. Классические эксперименты Михаэлиса и Ментен послужили эталоном почти для всех последующих исследований в области ферментативной кинетики, поэтому этих ученых считают основателями современной энзимологий, а уравнение (2.2) [в современной форме уравнение (2.8), приведенное ниже ] обычно называют уравнением Михаэлиса — Ментен.

. Примерно в то же время вал Слейк и Куллен [143 ] получили сходные результаты с ферментом уреазой. Они предложили аналогичный механизм, существенное отличие которого состояло в том, что первая стадия считалась необратимой:

E+S ES-* Е + Р. е0 — х s х р

В этом случае х, конечно, нельзя выразить через константу равновесия. Вместо этого мы имезм

2*

dx/dt = k+l (eQ — х) s — А+а х.

36

Глава 2

Ван Слейк и Куллен молчаливо подразумевали, что концентрация промежуточного соединения постоянна, т. е. dxld t = О, и поэтому

х = К1еШ -ft+e + A+ig]"

Следовательно,

Л+я + fc+1 s (fc+2/fc+i) + «

Это уравнение по форме совпадает с уравнением (2.2), и различить их экспериментально не представляется возможным.

Примерно в то время, когда были достигнуты первые успехи в понимании природы ¦ферментативног

страница 6
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

Скачать книгу "Основы ферментативной кинетики" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.06.2019)