Биологический каталог




Основы ферментативной кинетики

Автор Э.Корниш-Боуден

числом ферментов может иметь исключительно важное значение для живых организмов. Ньюсхолм и Джеверс [119] показали, что появление цикла в ключевой точке - контроля (например, цикла, состоящего из пары противоположно направленных реакций, катализируемых фосфофруктокиназой и фруктозодифосфатазой) может обеспечить более эффективный контроль суммарного потока по данному пути, чем кооперативные свойства отдельного фермента. Это обстоятельство объясняет присутствие фруктозодифосфатазы в мышце — факт, ранее казавшийся загадочным, поскольку глюконео-генез в мышце не протекает. Цикл, подобный описанному, представляет собой не что иное, как «бесполезный» цикл, так как налицо .«лишние» затраты АТФ, который идет, однако, на выполнение очень важных регуляторных функций.

Г лава 8

Анализ кинетических кривых

8.1. Уравнение скорости в интегральной форме

Кинетическое уравнение можно записать двумя различными способами: либо в виде зависимости концентрации реагента от времени, либо в виде зависимости скорости реакции от концентраций реагентов. В энзимологии чаще пользуются второй формой записи, в то время как в химии — первой. Химики отдают предпочтение, как правило, интегральным уравнениям скорости, имею-, щим то преимущество, что в них входят величины, непосредственно измеряемые экспериментально. Однако, как. видно из гл. 2, первые исследователи ферментативной кинетики, пытаясь применить обычные приемы химической кинетики для описания экспериментальных данных при помощи интегральных уравнений, встретились с большими трудностями. Эти трудности были в. значительной степени преодолены благодаря работе Михаэлиса и Ментен [113], показавших, что более простой способ изучения кинетических свойств ферментов состоит в измерении начальных скоростей реакций. В этом случае можно пренебречь накоплением продукта и расходованием субстрата, которые осложняют анализ всей кинетической кривой. Нежелательным последствием широкого применения этого подхода явилось, однако, то, что биохимики теперь избегают применять интегральные уравнения скорости даже в тех случаях, когда это вполне оправданно.

На начальном этапе исследования кинетических свойств фермента, когда главная задача состоит в том, чтобы установить, какому уравнению подчиняются кинетические данные и каковы приблизительные значения кинетических параметров, измерения начальных скоростей вполне уместны. Следует стремиться при этом исключить влияние продуктов или вносить их в систему контролируемым образом. Однако по завершении этого предварительного этапа необходимо переходитьк изучению реакции во времени (когда происходит накопление продукта и исчезновение субстрата), поскольку в полной кинетической кривой содержится гораздо больше информации, чем просто в значении скорости, полученном экстраполяцией к нулевому моменту времени. Точные значения кинетических параметров можно получить из относительно небольшого числа экспериментов. Важно также от-.

Анализ кинетических кривых 199

метить, что анализ полных кинетических кривых позволяет избежать субъективных ошибок, неизбежных при определении начальных скоростей из нелинейных графиков.

$.2. Интегральная форма уравнения Михаэлиса — Ментен

Прежде чем приступать к интегрированию уравнения Миха-. элиса—Ментен (или любого другого уравнения скорости), в него необходимо ввести все возможные соотношения, которые существуют между концентрациями реагентов. Так, концентрация ¦субстрата яи концентрация продукта р не являются независимыми величинами, поскольку их сумма всегда постоянна. Одну из этих величин (либо s, либо р) нужно исключить из уравнения, воспользовавшись равенством s -f- р = s0. Тогда соответствующей формой уравнения Михаэлиса—Ментен будет уравнение (2.11)

dp _ V(s<,— р\ ,о -ч

at KM+s0-p • \°-х>

Проводя интегрирование

C(KM + ^dp С ^ Г

J «о — Р J*o — Р J '

получаем'

~(KK + s0)ln(s0~p) + p + s0 ln(s0—p)=Vt + а. Условие р = 0 при t = 0 дает а = —Км и, следовательно, Vt = p + KMln[s0/(s0 — p)],

или

Ff = So-S.+ tfMln(So/s)- (8.2)

Уравнение (8.2) представляет собой интегральную форму уравнения Михаэлиса—Ментен. Оно определяет временной ход (или кинетическую кривую) реакции, для которой уравнение Михаэлиса—Ментен продолжает выполняться на протяжении длительного промежутка времени после начала реакции. В уравнении (8.2) t выражено через р, а не наоборот, как нам хотелось бы, однако это не создает особых неудобств при его использовании.

Кроме того, из двух вариантов записи уравнения ( и других уравнений скорости в интегральной форме) целесообразно использовать тот, при котором в уравнение входит член с ln(s0/s),— это позволяет избежать недоразумений, которые могут возникнуть в том случае, когда в систему в начальный момент времени добавлен продукт, т. е. когда р0 Ф 0.

200

Глава 8

Как и в случае дифференциальной формы уравнения Михаэлиса—Ментен, для уравнения (8.2) можно предложить несколько линейных анаморфоз:

1 . = _1Г So~s ] + (8.3),

In (s0/s)

~- = V--^-In(V*), (8.4*

В соответствии с уравнением (8.3) зависимость tll^sjs) от (s0 — s)/' /ln(s0/s) графически представляется прямой с наклоном, равным 1/F; эта прямая отсекает на оси ординат отрезок, равный Kk.IV. Таким образом, данная линейная анаморфоза подобна графику зависимости s/v от s при анализе начальных скоростей. Аналогичным образом могут быть построены линейные анаморфозы^ соответствующие уравнениям (8.4) и (8.5) и сходные с графиками зависимости v от vis и IIv от lis соответственно. Во всех трех случаях можно в принципе определить параметры V и Км из= одной кинетической кривой. Чтобы это определение было надежным, необходимо, с одной стороны, использовать начальные концентрации субстрата s0, заметно превышающие Kt\, и с другой — наблюдать за реакцией до тех пор, пока величина (s0—s) не станет заметно больше, чем Км. Кроме того, чтобы применять подобные подходы, необходимо быть уверенным в том, что ингибирование продуктом реакции практически отсутствует. При измерении начальных скоростей ингибированием продуктом, как правило, можно пренебречь, если следить за реакцией на протяжении небольшого промежутка времени, когда концентрация продукта практически равна нулю. Если же за реакцией наблюдают длительное время, то исключить ингибирование продуктом уже не удается. Кроме того, располагая единственной кинетической кривой, нельзя отличить замедление реакции, связанное с расходованием субстрата, от любого торможения процесса, обусловленного' конкурентным ингибированием накапливающимся продуктом. Об этом удивительном свойстве подобных линейных анаморфоз никогда не следует забывать. Подробнее данный вопрос будет рассмотрен в следующем разделе.

Из трех линейных анаморфоз уравнения (8.2) наиболее часто, по-видимому, применяется анаморфоза (8.4). Впервые она была использована Уолкером и Шмидтом [147] при исследовании гис-тидин—аммиак-лиазы. Однако в соответствии с характером изложения материала по линейным анаморфозам в последующих разделах книги мы будем использовать вместо уравнения (8.4) уравнение (8.3) и аналогичные уравнения. Их несколько проще, чем*

Анализ кинетических кривых

201

уравнение (8.4), можно преобразовать к виду, удобному для анализа очень важного случая конкурентного ингибирования продуктом реакции.

8.3. Конкурентное ингибирование продуктом реакции

Если мы не располагаем данными о том, насколько существенно ингибирование продуктом реакции, то из осторожности следует допустить, что оно существует, и в анализ кинетических кривых включить расчет константы ингибирования продуктом. В качестве основного дифференциального уравнения следует использовать не уравнение (8.1), а уравнение вида

dp__^(so— Р) _ ^gg\

dt кк (! + PlKp) +so — P '

Оно получено преобразованием уравнения (2.22), однако а заменена на s, с тем чтобы подчеркнуть то обстоятельство, что мы ограничиваемся здесь рассмотрением необратимых реакций. По этим же соображениям Vf, Км и К% записаны просто как V, Км и Кр; величина s представлена как (s0— р), поскольку вир должны рассматриваться как переменные, связанные уравнением материального баланса s + р = s0. Если преобразовать уравнение (8.6) к виду

dp__V (s0 — р)_ /о 7ч

dt #м+*о-(1-#м/*р)Р ' 1 '

оно становится аналогичным уравнению (8.1). Поэтому при анализе единичной кинетической кривой влияние конкурентного ингибирования продуктом нельзя отличить от эффекта, вызываемого истощением запасов субстрата. Если же анализируются несколько кинетических кривых, полученных при различных значениях s0, то эти два случая становятся различными, так как -«константа» {Км + «о) меняется при варьировании s0. Здесь следует сделать маленькую оговорку: коэффициент перед р в знаменателе уравнения (8.1) равен —1, однако в уравнении (8.7) он равен —(1—Ки/Кр), т. е. нулю, если Км = Кр, и положительной величине, если Км> Кр. Может показаться, что случай Км = = Кр настолько маловероятен, что его можно без опасений не рассматривать. Однако это не так: если величина Км близка к Ks и если S и Р содержат близкие по структуре группы, определяющие связывание с ферментом, то вполне может оказаться, что Кр » ¦хКм- В этом случае уравнение (8.7) принимает следующий вид:

-37- = k(s0 — p) = ks, at

202

Глава 8

где к соответствует V/(Km + s0) и является простой константой скорости первого порядка (гл. 1). Этот случай, однако, нетрудно отличить от обычной реакции первого порядка, так как «константа» скорости является функцией s0.

Поскольку уравнение (8.7) совпадает с уравнением (8.1), его можно проинтегрировать точно таким же образом [74, 80, 129]. После интегрирования получаем

Vt = (1 -KJKP)(s0 -s) + Kn(i + s0/KP) In (s0/s). (8.8>

Это уравнение также можно представить в линейной форме, например

или двумя другими способами по аналогии с уравнениями (8.4) и (8.5). В этом случае в координатах {(s0—s)/ln(s0/s); r/ln(s0/s)}Mbi снова получаем прямую, наклон которой равен теперь (1 —Km/Kp)/V, а отсекаемый отрезок — Кы{1 + s0/Kp)/V. Очевидно, что из одной прямой нельзя определить три константы, од

страница 38
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

Скачать книгу "Основы ферментативной кинетики" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.06.2019)