Биологический каталог




Основы ферментативной кинетики

Автор Э.Корниш-Боуден

, метод Кинга — Альтмана дает полученное ранее выражение, умноженное на к_5. Выражение, соответствующее EBQ, получается путем умножения исходного выражения для EQ на k+6b. Таким образом, [EBQ]/[EQ] = = k+5b/k_5, и EQ, В и EBQ находятся в равновесии. Уравнение скорости для механизма, включающего ингибирование, которое связано с наличием в схеме тупика, совпадает поэтому с уравнением скорости для механизма, в котором ингибирование отсутствует, ва исключением того, что члены в знаменателе, соответствующие EQ, должны быть умножены на (1 + fc+5b/ft_5).

Наконец, анализ вида графа ферментативной реакции может быть использован для установления общих свойств механизмов, содержащих две формы, не связанные мономолекулярными стадиями. Например, в приводимом ниже механизме Е и Е'связаны только бимолекулярными стадиями.

В

¦ЕА

R

.ЕАВ Е'Р

ER

EQR

-Е'

Поскольку каждое дерево, выбранное по методу Кинга — Альтмана, должно содержать ветви, ведущие от Е, Е' или от обеих форм, каждое слагаемое в уравнении скорости должно включать

76

Глава 3

по меньшей мере один концентрационный член. Другими словами, в уравнение скорости не должны входить члены, являющиеся константами. Развивая эти идеи, можно показать, что если в механизме имеются три подобные формы, то каждое слагаемое в уравнении скорости должно содержать по меньшей мере два концентрационных члена. Механизмы подобного типа называют механизмами с замещением дЗермента (substituted-enzyme mechanisms); они рассмотрены в гл. 5.

3.8. Представление уравнений скорости в форме, содержащей коэффициенты

Часто бывает удобным представить уравнения скорости в форме, содержащей вместо кинетических констант коэффициенты, как это было сделано в разд. З.З4 [уравнение (3.4)]. Во-первых, уравнение становится более простым по сравнению с уравнением, выраженным через константы скорости; во-вторых, следует иметь в виду, что константы скорости могут не быть истинными константами скорости отдельных стадий из-за процессов изомеризации, которые не проявляются в кинетических измерениях; в-третьих, коэффициенты — это в принципе измеримые величины. Однако, если ставится задача выбрать тот или иной кинетический механизм ферментативной реакции, Очень важно установить, как связаны между собой коэффициенты. Рассмотрим следующие два уравнения:

в которых Км\, Kiwi L, иКт —положительные константы. Оба уравнения применимы к ферментам, содержащим два активных центра. В то время как в случае уравнения (3.5) предполагается, что активные центры характеризуются различными значениями Км и действуют независимо друг от друга, для уравнения (3.6) принято, что они взаимодействуют в соответствии с симметричной моделью Моно, Уаймена и Шанжё ([116]; см. разд. 7.7). В обоих случаях допускается, что константы каталитического распада для двух центров идентичны. Однако конкретное содержание этих двух уравнений в данном случае неважно. Существенно то, что в форме, содержащей коэффициенты, оба уравнения идентичны:

Vs , Vs

(3.5)

v ~

Km + s км2 + s ' V [(Ls/KT ) ( 1 + sJKT ) + ( s/KR ) (1 + s/A-r )] L(i+s/KTf + (l + s/KR)*

(3.6)

v =

CiS 4- ca s2

c3 + C4S + s2

В то же время было бы ошибочно думать, что уравнения (3.5)

Как выводить уравнения стационарной скорости

77

и (3.6) совершенно одинаковы. Недостаток последнего уравнения •состоит в том, что оно маскирует любые соотношения, которые существуют между коэффициентами. Рассмотрим коэффициенты с3 и С3 = ^М2 »

А ~ ^mi + Km'

Поскольку как К^и так и Км2 должны быть положительными величинами, коэффициенты с3 и сл не являются совершенно независимыми: они связаны неравенством

с*»4с3. (3.7)

В случае уравнения (3.6) коэффициенты с3 и сл выражаются следующим образом:

L + 1

L

ю-2 + тЛ Ат л.]

Из этих уравнений также вытекает определенное соотношение между коэффициентами с3 и с4:

<<4с3. (3.8)

За исключением частного случая, когда с24 = 4с3, уравнения (3.7) и (3.8) исключают одно другое. Это означает, что исходные модели, определяемые уравнениями (3.5) и (3.6), не перекрываются и в любом эксперименте можно провести их дифференциацию.

Глава 4

Ингибиторы и активаторы

4.1. Обратимые и необратимые ингибиторы

Соединения, которые при добавлении их в реакционную смесь вызывают уменьшение скорости ферментативной реакции, называются ингибиторами. Ингибирование может возникать по многим причинам, и поэтому существует много различных типов ингибиторов. Один из классов ингибиторов, не представляющих, впрочем, особого интереса для ферментативной кинетики (за исключением случаев, когда они выступают как фактор, искажающий результаты эксперимента), это необратимые ингибиторы, или каталитические яды. Ингибиторы этого типа, взаимодействуя с ферментом, снижают его активность до нуля. Многие ферменты отравляются следовыми количествами ионов тяжелых металлов, и поэтому кинетические исследования обычно проводят в присутствии комплексообразующих агентов, например этилендиаминтетраук-сусной кислоты. Это обстоятельство особенно важно учитывать при очистке ферментов: в неочищенных препаратах общая концентрация белка довольно высока и многие примеси белкового происхождения связывают почти все присутствующие ионы металлов, однако по мере очистки препарата фермента защитное действие других белков уменьшается и добавление дополнительных связывающих агентов становится необходимым. В некоторых случаях введение необратимых ингибиторов, напротив, может оказаться полезным. Например, отравление ферментов соединениями двухвалентной ртути часто используется для выяснения вопроса о роли сульфгид-рильных групп в активности ферментов. Однако этот аспект применения необратимых ингибиторов носит сугубо качественный характер и не имеет отношения к кинетике. Поэтому каталитические яды в дальнейшем обсуждаться не будут.

Гораздо более важным классом ингибиторов является класс обратимых ингибиторов. Эти ингибиторы образуют с ферментом динамические комплексы, которые отличаются по своим каталитическим свойствам от свободного фермента. Фермент в присутствии ингибитора может характеризоваться более высоким значением Км (конкурентное ингибирование), более низким значением"^ (чистое неконкурентное ингибирование), значениями V и Км, уменьшенными в одинаковой степени (бесконкурентное ингибирование), или определенной комбинацией этих эффектов (смешанное ингибирование).

Ингибиторы и активаторы

79

Возьмем за основу механизм, предложенный Боттсом и Мора-лесом [16]. Большинство простых типов ингибирования являются частными случаями этого механизма.

S

Эта схема включает четыре формы фермента (Е, ES, EI и EIS) и шесть реакций, протекающих между ними. Все простые случаи можно получить, если не учитывать некоторых реакций. Так, ингибирование является конкурентным (разд. 4.2), если отсутствуют форма EIS и протекающие с ее участием реакции; неконкурентным (разд.. 4.4), если отсутствует EI, и смешанным (разд. 4.3), если в схеме присутствует как форма EI, так и форма EIS, однако прямой переход между ними невозможен. Схема Боттса — Мора-леса особенно полезна при анализе ингибиторов, которые не являются продуктами реакции. Несмотря на то что продукты реакции составляют важный класс ингибиторов и по своим кинетическим свойствам' близки к ингибиторам, не являющимся таковыми, их связь с рассмотренной схемой менее очевидна.

Некоторые исследователи дифференцируют форму EI, в которой ингибитор связан с субстратсвязывающим центром, и форму IE, в которой ингибитор связывается с другим центром. Это разграничение не имеет большого практического смысла, поскольку механизмы, содержащие одновременно как EI, так и IE, обычно не встречаются.]} общем случае, если форма EIS реально существует, можно допустить, что ингибитор и субстрат связываются с разными центрами.

Схема Боттса —- Моралеса описывает также некоторые механизмы действия активатора, когда добавленное вещество повышает скорость реакции. Поэтому ее можно рассматривать как общую схему, описывающую механизм действия модификатора, в котором под модификатором подразумевают как ингибиторы, так н активаторы.

80 Глава 4

4.2. Конкурентное ингибирование

Самый распространенный тип ингнбирования назван конкурентным ингибированием, поскольку наиболее простое объяснение этого типа ингнбирования сводится к тому, что ингибитор связывается с тем же самым центром молекулы фермента, что и субстрат, с образованием непродуктивного комплекса. Другими словами, субстрат и ингибитор -конкурируют за один и тот же центр связывания и, следовательно, может образоваться только один комплекс фермента с ингибитором — EI. В простейшем случае конкурентного ингибированил EI представляет собой «тупиковый» комплекс, поскольку распадается он только в результате диссоциации на исходные компоненты (Е -f- I). Поэтому концентрация комплекса EI определяется истинной константой равновесия Ki = [E][I]/[EI] (см. разд. 3.7), которую называют константой ингибированил. Для многих более сложных типов ингнбирования, включая и большинство типов ингибирования продуктом реакции, константу ингибирования нельзя рассматривать как истинную константу равновесия, потому что комплекс фермента с ингибитором не является «тупиковым».

Полное уравнение стационарной скорости для случая простого конкурентного ингибирования имеет следующий вид:

__Vs_

У~ Kn(l + i/Ki)+s •

где i — концентрация свободного ингибитора, а V и Км имеют прежний смысл. Это уравнение совпадает по форме с уравнением -Михаэлиса — Ментен, т. е. его можно записать как

^М, каж + 8 "

где VK&m и ^М-КаЖ— «кажущиеся» значения параметров V и Км, которые определяются следующими выражениями:

V — V

' каж — ' i

При этом

v ,к У1К*

v каж/ ^м.каж — 1 + t'//Cj "

Следовательно, влияние конкурентного ингибитора на скорость ферментативной реакции состоит в том, что он увеличивает кажу-1 щееся значение Кмв (1 + ПК?) раз, уменьшает в то же число раз кажущееся значение VIКм и оставляет без изменения величину V.

(4.1)

Ингибиторы и активат

страница 14
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

Скачать книгу "Основы ферментативной кинетики" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.06.2019)