Биологический каталог




Фотобиология

Автор С.В.Конев, И.Д.Волотовский

жевых клетках особые флуоресцентные активаторы, содержание которых точно соответствует количеству фотолиазы. В спектре возбуждения флуоресценции этого вещества обнаруживаются максимумы при 280 и 358 нм. Активатор примерно в 2 раза увеличивает эффективность высоко-очищенной фотолиазы и не оказывает никакого эффекта при добавлении к препаратам энзима, еще не подвергнутым дополнительной очистке. Не исключено, что данный активатор, по всей видимости и являющийся хромофорной группировкой фотолиазы, теряется в ходе очистки энзима. Именно поэтому не удавалось обнаружить какого-либо ощутимого поглощения у очищенного фермента в области спектра 320—450 нм.

Прямые указания на существование активатора (кофактора) в составе фотолиазы получены также Г. Б. За-вильгельским. Для получения высокоочищенных препаратов фотореактивирующего фермента им была использована изящная методика, основанная на различии констант связывания фотолиазы с субстратом (пирнми-диновые димеры в ДНК) и необлученной ДНК. В раствор, содержащий фотолиазу, опускалась УФ-облученная пленка, приготовленная из «сшитой» ДНК, при этом фотолиаза избирательно комплексировала с пиримидино-выми димерами ДНК. Затем пленка последовательно помещалась в буферные растворы с возрастающей ионной силой. Сначала смывались неспецифически адсорбированные на ДНК белки, а при ионной силе 0,2—0,4 — фотолиаза. Высокоочищенный препарат фермента обнаруживал в спектре поглощения кроме белкового (278 нм) дополнительные максимумы приблизительно при 330, 370 и при 418 нм, которые можно было приписать кофактору. Препарат люминесцировал с максимумами спектра флуоресценции при 435 и возбуждения флуоресценции при 355 нм.

Исходя из вышеописанных данных, можно допустить, что фотолиазы в клетке находятся в стехиометрическом комплексе с активатором (кофактором) и что свет, поглощаемый активатором, каким-то образом (возможно, через конформационное возмущение фермента или через использование энергии электронно-возбужденного состояния для нужд катализа) увеличивает ферментативную активность в значительно большей степени, чем свет, поглощенный самим ферментом.

Иным образом объясняет несоответствие спектров действия фотореактивации и поглощения фотолиазы американский исследователь Сазерленд. По ее мнению, поглощением в области 320—450 нм обладает не сама фотолиаза и не какая-нибудь слабосвязанная с ней группировка, а комплекс фермента с облученной ДНК. В качестве доказательства этого положения Сазерленд приводит результаты спектрофотометрических измерений, в которых для комплекса облучения фотолиаза+ДНК были зарегистрированы изменения поглощения в области спектра 320—420 нм. В противоположность этому в контрольном варианте опыта (фотолиаза+ необлученная ДНК) никаких изменений поглощения обнаружить не удалось.

Как уже упоминалось, фотореактивирующий энзим обладает повышенным сродством к пиримидиновым ди-мерам и его действие сводится к их мономеризации. С наибольшей скоростью мономеризуются димеры тимина,

с меньшей — смешанные димеры Ц—Т и Т—У и с еще

I ? 1 f——I

меньшей — димеры У—У и Ц—Ц. Другие продукты ди-мерной природы, например «споровый» продукт или сшивки ДНК—ДНК и ДНК — белок, не фотореактиви-руются.

Как и при всякой ферментативной реакции, между ферментом и субстратом (облученной ДНК» или синтетическим полинуклеотидом) в темноте образуется устойчивый комплекс, который может быть выделен путем ультрацентрифугирования или гельфильтрации. Размеры сорбционного центра фермента достаточно велики, поскольку фрагменты политимидиловой кислоты, содержащие менее девяти мономеров, с ним не комплексируют. В отличие от обычных ферментативных реакций каталитический акт в фермент-субстратном комплексе фотореактивирующий энзим — облученная ДНК не протекает без видимого света, т. е. фермент работает в электронно-возбужденном состоянии. Прн постоянной интенсивности света реакция мономеризации подчиняется кинетическому уравнению Михаэлиса — Ментена:

fei hv

Е + S^Z\ES Е + Р.

По данным Харма, для ДНК Е. coli в клетке &I = 1,1X Х10-6 л• моль-1 • с-1, k-i=* 1,9-10-4-1,3.Ю-2, энергия активации образования фермент-субстратного комплекса равна 11, а его распада — 4,5 ккал/моль.

Принципиальное сходство механизмов фотореактивации in vivo и in vitro доказывается опытами с мутантами: штамм Е. coli phr-, дефектный по фотореактивирую-щему энзиму, не только сам не обладает способностью к фотореактивации, но и его экстракты лишены этой способности в модельных опытах.

Фотореактивация второго типа (фотореактивация II, или непрямая фотореактивация) не насыщается при высоких интенсивностях света и характеризуется спектром действия с максимумом при 340—350 нм. В противоположность фотореактивации I фотореактивация II не зависит от температуры, и клеточные экстракты на свету с длиной волны 340 нм не устраняют повреждения, фото-реактивируемые в клетке. Это указывает на неферментативную природу фотореактивации 11. Характерно, что при фотореактивации II димеры тимина не расщепляются и этот тип фотореактивации, по-видимому, по своему механизму близок к фотопротекции.

Существует несколько рабочих гипотез, исходя из которых пытаются объяснить механизм фотореактивации II. Согласно одной из них, свет с длиной волны 334 нм подавляет рост и деление клеток, создавая тем самым благоприятные условия для работы системы темновой репарации — повышение эффективности выщепле-ния — замещения димеров. Исходя из другой гипотезы, непрямую фотореактивацию связывают с разрушением в клетке хинонов, входящих в состав электронно-транспортной цепи.

Фотореактивация 111 характеризуется более высокой квантовой эффективностью и спектром действия с максимумом при 313 нм. Как и фотореактивация II, она практически не зависит от температуры и скорости дозы облучения. Эффект увеличения выживаемости при инкубации в жидких средах (liquid-holding recovery) при ней не наблюдается. Фотореактивация III также имеет неэнзи-матическую природу. По мнению Джаггера, в основе этого процесса лежит фотолиз урацил-тиминовых аддуктов, которые выделены из облученных ДНК в растворе и в

клетке, имеют максимум поглощения при 313 нм и эффективно фотолизируются светом.

Необходимо отметить, что фотореактивация всех трех типов может иметь место у различных организмов в самых разнообразных комбинациях. Например, спектр действия фотореактивации Е. coli (рис. 55) имеет три максимума (313, 350 и 385 нм), соответствующие трем типам фотореактивации, спектр действия фотореактивации Streptomyces griseus— два (313 и 436 нм), соответствующие фотореактивации I и II, а у мутантов 5. griseus РНР-1 и S. coelicolor представлена только фотореактивация III.

Для бактериофагов отмечена также ультрафиолетовая или W-реактивация, которая заключается в увеличении выживаемости УФ-облученных фагов в результате повторного облучения коротковолновым ультрафиолетом (250—300 нм) системы фаг — бактерия или даже клетки-хозяина перед инфицированием. По механизму этот процесс отличается как от обычной фотореактивации,

так и от темновой репарации и связан, как стало ясно в последнее время, с SOS-репарирующей системой (см. § 3). Показано, например, что и другие воздействия, приводящие к репарируемым повреждениям ДНК, сопровождаются реактивацией фага, аналогичной ультрафиолетовой.

2. ФОТОПРОТЕКЦИЯ

Фотопротекция — это уменьшение чувствительности к ультрафиолетовому свету после предрадиационного облучения клеток видимым или длинноволновым ультрафиолетовым светом. В результате такого предварительного облучения Е. coli удается повысить выживаемость бактерий при УФ-облучении с 1 до 40%. В противоположность фотореактивации фотопротекция обнаружена у ограниченного числа представителей микроорганизмов, простейших и растений и наблюдается даже у тех клеток (мутантов), которые не способны к фотореактивации. Эффект фотопротекции описывается многоударной кривой, не зависит от температуры (Qio—1,05) и представляет собой неэнзиматический процесс. Фотопротекция наблюдается при меньших дозах, чем фотореактивация.

Спектр действия фотопротекции представлен достаточно узкой полосой с максимумом, положение которого у различных клеток варьирует от 310 до 340 нм. Природа хромофора, участвующего в этой реакции, не выяснена, как и фотофизические и фотохимические стадии процесса. Обращает на себя внимание параллелизм между величиной эффекта и степенью подавления дыхания и деления клеток при облучении светом. Причиной подавления дыхания и, как следствие, деления может быть обнаруженное фоторазрушение хинонов в клетке, которые, как известно, участвуют в работе электронного каскада. В свою очередь увеличение межмитотического интервала благоприятствует темновым репарационным процессам, в результате которых устраняются фотохимические повреждения ДНК- Подтверждением этого представления является совпадение спектров действия фотопротекции и задержки клеточного деления Е. coli. Все это позволило некоторым авторам рассматривать фотопротекцию как вариант фотореактивации II.

3. ТЕМНОВАЯ РЕПАРАЦИЯ

Одним из основных путей устранения клеткой опасных для жизни повреждений генома является выработанный в ходе эволюции ферментативный аппарат темновой репарации. Основной принцип работы этого аппарата заключается в удалении (эксцизии) фотохимически поврежденных участков полинуклеотидной цепи с последующей застройкой дефекта нормальными молекулярными компонентами (нуклеотидами). Результат деятельности системы темновой репарации — прогрессирующее во времени уменьшение содержания димеров в ДНК клетки .после УФ-облучения, сопровождающееся стехиометриче-ским ростом концентрации свободных, не включенных в

состав ДНК димеров в цитоплазме. При этом вырезанные пиримидиновые димеры обнаруживаются в кислотораст-воримой фракции цитоплазмы. Вещества, ингибирующие работу ферментов темновой репарации,— кофеин, акридиновые красители, липиды — резко повышают фоточувствительность клеток.

Впервые на существование в клетке темновой репарации указали в 1964 г. Сетлоу и Кэрие, Бойс и Ховард?* *?

?* *?WW

Рис. 56. Эксцизионная темнов

страница 53
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69

Скачать книгу "Фотобиология" (3.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2019)